Capítulo V – Parte experimental
6. Análise de amostras
6.1.
Selecção das amostras
Foram adquiridas 148 amostras entre Maio de 2007 e Dezembro de 2008, em supermercados e hipermercados, lojas de produtos biológicos, farmácias e outros locais de venda de produtos alimentares de Lisboa e da margem sul do Tejo (Almada e Seixal). As amostras recolhidas são maioritariamente amostras destinadas à alimentação infantil, abrangendo a faixa etária compreendida entre os 4 meses e os 3 anos, tendo sido também incluídas amostras de sumo à base de maçã destinadas aos consumidores em geral. As amostras foram agrupadas por grupo etário e por tipo de matriz (Tabela V.6):
No anexo 1 apresentam-se as características dos sumos e purés incluídos no presente estudo.
As amostras foram seleccionadas de acordo com os seguintes critérios:
− Puré de fruta com teor de maçã igual ou superior a 50%, rotuladas especificamente para lactentes e crianças jovens, representando a grande maioria das marcas disponíveis no mercado, no período em que foram adquiridas.
− Sumos 100% maçã rotulados especificamente para crianças.
− Sumos de maça, límpidos e turvos, com teor de maçã igual ou superior a 50% (biológicos e convencionais) destinados aos consumidores em geral.
Tabela V.6: Amostras agrupadas de acordo com o grupo etário e tipo de matriz.
De forma a obter uma amostra representativa foram adquiridas várias unidades da mesma amostra, pertencentes ao mesmo lote, de forma a perfazer pelo menos 600 g de puré ou 600-1000 mL de sumo.
Na maioria dos casos foram adquiridos e analisados 2 lotes de cada produto.
As amostras foram armazenadas à temperatura ambiente ou a 5 ± 3 ºC, de acordo com as indicações do rótulo, até à sua abertura e armazenadas a -20 ºC após abertura. Todas as amostras foram analisadas dentro do respectivo prazo de validade.
Grupo etário Matriz Descrição
Lactentes e crianças jovens
Puré à base de maçã
Purés de fruta com 100% maçã ou com maçã e outros frutos, biológicos e convencionais, incluindo também nalguns casos cereais e baunilha
Lactentes e crianças jovens
Sumo límpido 100% maçã
Sumo límpido 100%, preparado a partir de concentrado de maçã
Adultos/consumidores em geral
Sumos límpidos
Sumo límpido 100%, preparado a partir de concentrado de maçã
Adultos/consumidores
em geral Sumos turvos
Sumos turvos com 100% maçã ou com maçã e outros frutos, biológicos e convencionais
6.2.
Toma de ensaio
Para preparar a toma de ensaio de purés misturar o conteúdo de 7 embalagens com peso unitário de 90 g ou 6 embalagens com peso unitário de 120 g, de modo a perfazer no mínimo, 600 g. Após homogeneização retirar 10 g para análise e congelar cerca de 50 g de amostra a -20 ºC.
No caso dos sumos utilizar uma embalagem de 1000 mL ou pelo menos 3 embalagens de 200 mL. Após homogeneização retirar 10 g para análise e congelar cerca de 50 g de amostra a -20 ºC.
6.3.
Análise de patulina pelo método de SPE-HPLC-UV
A patulina é analisada pelo método do padrão externo. As condições cromatográficas são as estabelecidas nas tabelas V.1, V.2 e V.3.
Em cada série de trabalho injectar os 5 padrões de calibração da patulina, representativos da gama de trabalho (8, 16, 25, 50 e 100 µg/L) e traçar a curva de calibração, área vs concentração de patulina (µg/L).
Em cada série de trabalho seguir a seguinte ordem de injecção: − Branco cromatografico (fase móvel)
− Branco de solvente (água a pH=4)
− Padrões de calibração (8, 16, 25, 50 e100 µg/L) − Controlo cromatográfico 1 (± 8 µg/L) − Controlo de fortificação (± 40 µg/L) − Amostras − Duplicados − Ensaio de recuperação − Controlo cromatográfico 2 (± 25 µg/L)
Na análise dos extractos, identificar o pico da patulina na amostra, por comparação do respectivo tempo de retenção (tR) com o tempo de retenção do pico cromatográfico da
patulina na solução padrão de calibração. Determinar a concentração de patulina na amostra de acordo com o descrito na secção 6.5 (cálculos).
6.4.
Controlo de qualidade interno (CQI)
Em cada série de trabalho analisar um duplicado e efectuar um ensaio de recuperação por cada 20 amostras. Analisar um branco, dois controlos cromatográficos (8 e 25 µg/L) e um controlo de fortificação (40 µg/L) por série de trabalho. Esporadicamente são intercaladas na série de trabalho, amostras de material de referência (FAPAS ou Bipea). Registar o valor dos controlos, dos duplicados, das recuperações, do declive e da ordenada na origem nas cartas de controlo. Os valores de cada um destes parâmetros devem estar compreendidos dentro das linhas de controlo das respectivas cartas de controlo. No entanto, as séries de trabalho devem ser reavaliadas, quando os valores de qualquer um dos parâmetros estiverem entre as linhas de aviso e as linhas de controlo, principalmente, quando há uma tendência. Nestes casos, averiguar as causas de erro e desenvolver acções correctivas.
Quando qualquer parâmetro apresentar valores fora das linhas de controlo, repetir o ensaio inerente a esse parâmetro e avaliar de novo a série de trabalho. No caso de se confirmar fora de controlo, rejeitar e repetir a série de trabalho.
O valor do branco deve ser inferior ao limite de detecção cromatográfico (2,0 µg/L). Nos ensaios de rotina devem ser rejeitadas todas as curvas de calibração com um coeficiente de determinação (R2) inferior a 0,995.
As amostras devem ser lidas por interpolação na curva de calibração (dentro da gama de trabalho).
Na análise de duplicados, se as amostras seleccionadas para o ensaio apresentarem uma concentração inferior ao limite de quantificação para o método em análise, o resultado obtido é considerado nulo e a diferença de duplicados também é nula (DD% = 0).
A partir dos resultados da análise dos materiais de referência, calcular o erro (%) e utilizar este parâmetro para avaliar a exactidão do método
6.5.
Cálculos
A partir da área do pico de patulina na amostra e por interpolação na curva de calibração (área vs concentração), calcular a respectiva concentração (µg/L). Calcular o teor de patulina presente na amostra, em µg/kg, através da equação 16.
)
(
m
(mL)
v
)
(
v
(mL)
v
g/L)
(
C
g/kg)
(
1 2 1 3g
mL
Patulina
×
×
×
=
µ
µ
(equação 16)Se não houver alteração na massa de amostra, volume de solvente de extracção e alíquota de extracto, a equação pode ser expressa de forma abreviada:
0 1 2,5 0 1 1 g/L) ( C g/kg) ( × × × =
µ
µ
Patulina (equação 16) ,4 0 g/L) ( C g/kg) (µ
=µ
× Patulina (equação 16) Em que:C Concentração da solução de ensaio calculada a partir da cuva de calibração. m1 Massa da amostra utilizada para análise (10 g).
v1 Volume de solvente de extracção (10 mL).
v2 Alíquota para SPE (2,5 mL).