Análise do DNA

4.4.3.1) Extração do DNA

As voluntárias compareceram ao Laboratório de Estudos em Educação Física e Saúde (LEEFS), localizado no Campus I da Universidade Católica de Brasília, para que um profissional devidamente qualificado realizasse a coleta sangüínea na veia antecubital. O material biológico foi coletado em tubos de coleta estéreis contendo anticoagulante EDTA, sendo extraído um volume de 3 a 5 ml de sangue. O DNA genômico de alto peso molecular foi extraído dos leucócitos periféricos utilizando-se o método salting out (MILLER, DYKES, POLESKY, 1988). Vale destacar que este processo foi realizado por dois alunos do Programa de Pós-Graduação em Educação Física da Universidade Católica de Brasília.

a) Quebra das células com remoção das membranas lipídicas por meio da adição de um tampão com detergente. A solução usada no procedimento foi denominada Tampão A, composta por sacarose (0,32 M), Tris-HCl (10 mM, pH 7,6), MgCl2 (5 mM) e o detergente não iônico Triton X 100 (1%). Após a homogeneização

do sangue, um volume inicial de 750 µl foi depositado em um microtubo de 1,5 ml. Adicionou-se 750 µl do Tampão A, sendo o material centrifugado a 2.500 rpm por 20 minutos para condensação do pellet, com descarte posterior do sobrenadante.

b) Remoção das proteínas celulares e histonas ligadas ao DNA por meio da adição de uma protease e precipitação com sódio - o pellet foi suspenso em um composto denominado Tampão B (25 mM de EDTA com pH 8,0 e 75 mM de NaCl), sendo adicionado o SDS (do inglês, sodium dodecyl sulfate) a 10% e proteinase K (10 mg/ml). Em seguida, os tubos foram incubados a 55ºC durante uma hora para ativação das enzimas. Após a incubação foi adicionado NaCl (6 M), seguido de uma nova centrifugação da mistura com a finalidade de precipitar impurezas no fundo dos tubos.

c) Precipitação do DNA em álcool – transferiu-se o sobrenadante obtido no item anterior e foi adicionado etanol absoluto, na proporção de duas vezes o volume contido no tubo. Misturou-se por inversões cuidadosas, sendo nesse momento possível a visualização da precipitação do DNA. Foi realizada outra centrifugação com a finalidade de aderir o DNA no fundo dos microtubos, descartando-se em seguida o sobrenadante com cuidado para não perder o pellet. Após a evaporação completa do etanol, foram adicionados 300 µl de TE para conservação do DNA.

4.4.3.2) Quantificação do DNA

A concentração do DNA extraído previamente foi estimada por meio de gel agarose a 1%, corado com brometo de etídio. Em cada poço do gel foi aplicado um volume de 8 µl, sendo 4 µl tampão de carregamento (sacarose e azul de bromofenol) e 4 µl do DNA extraído e conservado em TE. Foi utilizado como padrão para quantificação DNA do fago lambda em concentrações de 20, 100, 200 e 400ng/µl. Após aproximadamente 15 minutos de eletroforese a 80 V, o gel foi fotografado em luz ultravioleta, sendo as “bandas” formadas pelo DNA comparadas com as dos marcadores, e, através da inspeção visual, foi realizada a quantificação do DNA. Veja figura abaixo:

FIGURA 9: Quantificação do DNA.

Após a quantificação, todas as amostras de DNA foram diluídas em TE, de forma que ficassem numa concentração final de 5 ng/µl e prontas para seguir para o processo de amplificação.

4.4.3.3) Polimorfimos no gene CNTF

O CNTF apresenta a seqüência genômica descrita no ANEXO C. A partir disto, buscou-se identificar os SNPs na região deste gene (~3,5Kb), utilizando do banco de dados dbSNPS (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) e foram encontrados 7 (rs17152776; rs2515363; rs1800169; rs17152779; rs6266; rs7113847; rs2515362). Posteriormente, utilizando a seqüência de iniciadores descrita por Thome et al. (1996), buscou-se encontrar o SNP identificado com a mutação nula do gene CNTF, e se pôde notar que o rs1800169 é o que vem sendo utilizado nos estudos de associação. Ademais, para identificar o alelo com a presença de guanina usou-se a letra ‘G’ e ‘A’ para adenina. Sendo assim, GG corresponde aos homozigotos sem a mutação nula, GA refere-se aos heterozigotos para a mutação nula e AA são os homozigotos com mutação nula. Para uma análise haplotípica também foram verificados os seguintes SNPs: rs2515363 (C/G), rs17152779 (A/G), rs6266 (A/G).

4.4.3.4) Amplificação do DNA

Para amplificação de um fragmento contendo os SNPs descritos no item anterior, foram desenhados iniciadores para amplificar um fragmento de 806 pb. Os iniciadores foram 5’-GAGAGTTTGAAGTGAGAAGG-3’ (direto), 5’- AGGGAACTACGCATATTCCA-3’ (reverso). Os iniciadores foram desenhados utilizando o programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi- bin/primer3/primer3_www.cgi).

A amplificação do fragmento do DNA que contém os SNPs de interesse foi realizada através da reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês Polymerase

Chain Reaction) em um termociclador da marca GeneAmp PCR System 9700,

(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), conforme figura abaixo:

FIGURA 10: Termociclador da marca GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA.

A PCR foi realizada em um volume final de 10µl, de acordo com o seguinte protocolo: Tampão 1x (1µl), dNTPs 250µM (1µl), iniciadores (direto e reverso) 20µM (0,12µl cada), enzima Taq DNA Polimerase 1U (0,2µl), 5ηg de DNA (4µl) e água milli-Q (3,56µl). Essa técnica permite que um fragmento específico da molécula de DNA seja amplificado milhares de vezes em poucas horas. A técnica implica na utilização de fragmentos de fita simples de DNA, os iniciadores, que delimitam a região a ser amplificada. A técnica de PCR é baseada na termoestabilidade da Taq DNA Polimerase. O fato ocorre, pois a enzima é extraída de uma bactéria (Thermus

de grande importância, uma vez que a reação processa-se em diferentes ciclos de temperaturas.

As condições da PCR consistiram de uma desnaturação inicial por 4 minutos à 95ºC, 30 ciclos de 1 minuto à 94ºC, 1 minuto à 55ºC e 1 minuto à 72ºC (desnaturação, anelamento e extensão, respectivamente), seguindo por uma duração final de 5 minutos à 72ºC (extensão). Em seguida, adicionou-se 3µl de tampão de carregamento à 5µl do produto amplificado da PCR para que fosse separado por eletroforese em 1% de gel agarose contendo brometo de etídeo, como pode ser visto na figura abaixo:

FIGURA 11: Fragmentos de DNA separados por eletroforese em gel agarose.

4.4.3.5) Purificação e Seqüenciamento

O processo de purificação compreendeu a adição de 0,5µl da enzima SAP (torna indisponível o excesso de dNTPs) e 0,05µl da enzima ExoI (torna indisponível o excesso de iniciadores) em 5µl do produto da PCR. Para a ação das enzimas a mistura foi incubada no termociclador conforme a seguinte programação: 30 minutos

a 37°C e 20 minutos a 80ºC. Posteriormente, foi preparada uma reação para cada iniciador, conforme o quadro abaixo:

Quadro 1: Volume dos reagentes necessário para o processo de extensão. Iniciador 1062: 2µl * Iniciador 1908: 2µl * Iniciador 1479: 2µl * Iniciador 1575: 2µl *

Big Dye: 1,5µl Big Dye: 1,5µl Big Dye: 1,5µl Big Dye: 1,5µl T.S.: 1,7µl ** T.S.: 1,7µl ** T.S.: 1,7µl ** T.S.: 1,7µl ** Água Milli-Q: 3,8 µl Água Milli-Q: 3,8 µl Água Milli-Q: 3,8 µl Água Milli-Q: 3,8 µl P.P.: 1,0 µl *** P.P.: 1,0 µl *** P.P.: 1,0 µl *** P.P.: 1,0 µl ***

* A concentração dos iniciadores foi de 1,6 µM; ** onde T.S. leia Tampão de Seqüenciamento; *** onde P.P. leia Produto Purificado.

*Iniciador 1062 (direto): 5’-GAGAGTTTGAAGTGAGAAGG-3’; Iniciador 1908 (reverso): 5’- AGGGAACTACGCATATTCCA-3’; Iniciador 1479 (direto): 5’-CAAGCTTATCGTACCTTCCA-3’; Iniciador 1575 (reverso): 5’-GTATAGCTTGATGGAAGTCACCT-3’.

Em seguida, as amostras foram submetidas a reação de seqüenciamento em um termociclador da marca GeneAmp PCR System 9700, (Applied Biosystems,

Foster City, CA, EUA), utilizando o seguinte programa: 96°C durante 1 minuto; 25 ciclos de 96°C em 10 segundos, 50°C em 5 segundos, 60°C em 4 minutos; 4°C até o momento em que o produto fosse retirado. Uma vez ocorrido este processo, foi dado início ao tratamento das amostras com acetato de sódio, etanol 100% (C2H5OH) e

etanol 70% (água destilada e etanol absoluto), para que os reagentes da PCR fossem removidos, e então ficasse somente o pellet (fragmentos de DNA referentes ao seqüenciamento). Este processo compreende as seguintes etapas (protocolo de purificação em placa de 96 poços):

• Para 10 µl de reação acrescentar 2 µl de acetato de sódio em cada poço; • Adicionar 40 µl de etanol 100% em cada poço;

• Inverter a placa 5 vezes;

• Centrifugar a 4000 rpm durante 40 minutos;

• Descartar o sobrenadante invertendo a placa e colocar imediatamente sobre o papel toalha;

• Centrifugar a placa invertida a 1000 rpm durante 10 segundos; • Adicionar 150 µl de etanol a 70% em cada poço;

• Inverter a placa 5 vezes;

• Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos;

• Descartar o sobrenadante invertendo a placa e colocar imediatamente sobre o papel toalha;

• Centrifugar a placa invertida a 1000 rpm durante 10 segundos;

• Deixar a placa secar em temperatura ambiente no escuro por uma hora.

A eletroforese foi em seguida realizada em seqüenciador automático de DNA (ABI PrismTM 377 DNA Sequencer, Applied Biosystems), com subseqüente análise dos eletroferogramas através do software Seq Scap/Applied Biosystems para que as amostras fossem caracterizadas nos seus respectivos genótipos.

4.4.3.6) Marcadores informativos de ancestralidade

Para estimar a ancestralidade genômica das voluntárias foi utilizada uma bateria de 13 SNPs informativos de ancestralidade que categoriza a amostra em ancestralidades africana, européia e ameríndia. Esta bateria de SNPs já é utilizada no Laboratório de Ciências Genômicas e Biotocnologia da Universidade Católica de Brasília. Da mesma forma que ocorreu no processo de extração do DNA, esta etapa do trabalho também foi realizada por alunos do Programa de Pós-Graduação em

Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília (VIEIRA et

al. 2006).