2.3 ANÁLISES BIOQUÍMICAS

2.3.1– Fraccionamento subcelular

As fracções microssomais das glândulas digestivas dos mexilhões obtiveram-se segundo o método de Livingstone e Farrar (1984) e Livingstone et al. (1985, 1989, 1995). Amostras compostas de 6 glândulas digestivas (2-3 gramas; n=3) foram pesadas para a determinação do peso húmido, e todos os procedimentos subsequentes realizados a 4ºC. As amostras foram homogeneizadas, ainda congeladas, com tampão de homogeneização composto por 10 mM de Tris-HCl pH 7,6 contendo 0,5 M de sacarose e 0,15 M de KCl, numa proporção de 1:3,5 (peso do tecido:volume de tampão). A homogeneização foi realizada com um homogeneizador Ultra Turrax T25 (Janke & Kunkel) durante 2 minutos, mantendo a amostra em banho de gelo. O homogeneizado foi seguidamente centrifugado a 500 g a 4 oC, durante 15 minutos e o sobrenadante centrifugado a 12000

g durante 45 minutos, também a 4 oC, numa centrifuga Beckman J2 MC. Este novo

sobrenadante foi posteriormente centrifugado a 100000 g durante 90 minutos numa ultra-centrifuga Beckman XL 80. O precipitado resultante desta centrifugação foi cuidadosamente lavado com um pequeno volume de tampão microssomal (20 mM Tris- HCl pH 7,6 e 20% glicerol (p/v)), a 100000 g durante 30 minutos. Este último precipitado é denominado fracção microssomal, que contém pequenas vesículas da membrana do retículo endoplasmático, os ribossomas. Por fim a fracção microssomal é ressuspendida em tampão microssomal de modo a resultar numa concentração proteica de 5 a 10 mg/ml (o que equivale a 1 grama de tecido fresco em 0,5 ml de tampão), guardando-se em alíquotas a –80 oC não mais de duas semanas. Esquematicamente, o procedimento foi o seguinte:

glândula digestiva homogeneizar

(sol. tampão homogeneização 1:3,5 p/v) centrifugar (500 g, 15 min) sobrenadante resíduo (12 000 g, 45 min) sobrenadante resíduo (100 000 g, 90 min)

sobrenadante resíduo microssomal lavar (sol. tampão microssomal, 100 000 g, 30 min)

2.3.2– Sistema Monoxigenase de Função Mista (Sistema MFO)

O sistema MFO, também denominado sistema de monooxigenase dependente do citocromo P450, é um complexo multienzimático que funciona como uma cadeia de transporte de electrões, cujos componentes principais são o citocromo P450 (CYP450) e a NADPH citocromo c reductase (NADPH-red). Os componentes do sistema MFO foram analisados na fracção microssomal da glândula digestiva de mexilhões M.

galloprovincialis por espectrofotometria UV-Vis

A - Citocromo P450 (CYP450)

As concentrações totais de citocromo P450 (CYP450) e o pico “418” (P418) foram quantificadas pela diferença de espectro de monóxido de carbono (CO) entre amostras

reduzidas com ditionite de sódio (Livingstone, 1988), usando um coeficiente de extinção de 91 mM-1cm-1 (Estabrook e Werringloer, 1978), num espectrofotómetro de feixe duplo UV-3000 Shimadzou. O protocolo laboratorial foi o seguinte:

- 1 ml de 100 mM Tris-HCl pH 7,6, 900 µl de água milli-Q e 100 µl de microssomas foram misturados e divididos por duas cuvetes;

- o monóxido de carbono foi borbulhado numa cuvete (amostra) com um fluxo de 70 bolhas min-1, durante 1 minuto. Seguidamente lê-se a linha de base com a cuvete da amostra e a de referência (sem CO), através de um varrimento de espectro entre os 400 e os 500 nm.

- adicionaram-se alguns grãos de ditionite de sódio às duas cuvetes e leu-se a diferença de densidade óptica entre os 400 e os 500 nm, em triplicado, utilizando a correcção da linha de base.

O pico a baixo comprimento de onda observado no mesmo espectro, com λmáx a cerca

de 418 nm, mas variando entre 416 e 420 nm (Livingstone e Farrar, 1984), foi também quantificado em termos de unidades arbitrárias. (altura do pico λmáx - 490nm x 103).

Segundo Livingstone e Farrar (1984), este pico pode ser devido a uma molécula resultante da quebra do citocromo P450, mas devido à sua grande abundância é geralmente classificada como uma outra hemoproteína, tal como um citocromo ou uma peroxidase.

O cálculo da concentração do citocromo P450 obtém-se da seguinte forma:

∆A x 106 _{pmol ml}-1 _{1 10}3 _µl

__________________ x __________________ x ______________ = pmol mg-1 prot ε (mM-1_cm-1_{) ½ V amostra (µl)* [prot] (mg ml}-1₎

(*) ½ V amostra – considera-se metade do volume da amostra pois esta é dividida por duas cuvetes. ∆A é a diferença de absorvância do pico obtido aos 450 nm.

Para a quantificação correspondente ao pico 418 é utilizada a seguinte equação: ∆A x 103 ₁₀3 _µl

________________ x _______________= unidades arbitrárias (u. a.) ½ V amostra (µl) * [prot] (mg ml-1)

*) ½ V amostra – considera-se metade do volume da amostra pois esta é dividida por duas cuvetes. ∆A é diferença de absorvância do pico obtido aos 418 nm.

B - Citocromo b5 (Cit b5)

O citocromo b5 foi quantificado de modo semelhante, medindo a diferença de

absorvância entre os 409 e os 425 nm, com um coeficiente de extinção de 185 mM-1cm-1 (Estabrook & Werringloer, 1978), cujo protocolo laboratorial foi o seguinte:

- em duas cuvetes colocaram-se 500 µl de 100 mM Tris-HCl pH 7,6; 400µl de água milli-Q e 50 µl de microssomas. Seguidamente regista-se a linha de base; - na cuvete da referência adiciona-se 50 µl de água milli-Q e na da amostra adiciona-se 50 µl de NADH (0,5 mg/ml de água milli-Q). Regista-se a diferença de densidade óptica entre os 400 e os 450 nm, em triplicado, utilizando a correcção da linha de base.

Os resultados da concentração do citocromo b5 obtêm-se a partir do seguinte cálculo,

onde é feita a correcção devida ao aumento da absorvância provocada pela adição do NADH:

(∆OD + 0,0007) V cuvete (µl) 106

_____________ x __________________ x ______________ = pmol b5 mg-1 prot

ε (mM-1_cm-1_{) V amostra (µl) [prot] (mg ml}-1₎

C - NADPH citocromo c reductase (NADPH -red)

A actividade da enzima NADPH citocromo c P450 reductase (NADPH-red) foi determinada através do aumento de absorvância a 550 nm provocada pela redução do citocromo c. O citocromo reduzido tem um máximo de absorvância a 550 nm e um coeficiente de extinção ε=19.6 mM-1_cm-1 _{(Shimakata et al., 1972). O princípio segundo}

o qual se fez a medição baseia-se na seguinte reacção: NADPH + H+ + 2 cit coxid NADP+ +2H+ + 2cit cred

A quantificação foi efectuada utilizando 50 µl de microssomas num volume final de 1 ml de solução, que também continha 500 µl de Tris-HCl 100 mM pH 7,6; 50 µl de KCN 20 mM; 300 µl de água milli-Q; 50 µl de citocromo c 1,2 mM. As cuvetes são pré- incubadas durante 1 minuto à temperatura ambiente, adiciona-se os 50 µl de microssomas e lê-se a linha de base. Posteriormente adiciona-se 50 µl de NADPH 6 mM, dando-se início à reacção de redução do citocromo c, e lê-se o aumento da densidade óptica. A quantificação da enzima é corrigida com o factor de correcção 0,0002 equivalente ao aumento da densidade óptica provocado pelos 50 µl de NADPH num volume final de 1 ml, ao qual se chama taxa química. A actividade da NADPH-red obtém-se da seguinte forma:

∆A* (min-1_{) V cuvete (µl) 10}3

_______________ x __________________ x ______________ = nmol min-1mg-1 prot ε (mM-1_cm-1_{) V amostra (µl) [prot] (mg ml}-1₎

D - NADH citocromo b5 reductase (NADH-red)

A quantificação desta enzima tem o mesmo princípio que a anterior, variando a quantidade de microssomas e de água, sendo 10 µl e 340 µl respectivamente. O factor de correcção utilizado para os cálculos da actividade da NADH cit b5 reductase foi de

0,00018, equivalente ao aumento originado por 50 µl de NADH.

2.3.3 – Determinação da concentração de proteínas

Todos os resultados das análises bioquímicas são referentes ao conteúdo proteico dos organismos analisados. Assim, para a determinação das proteínas microssomais totais foi utilizada uma modificação do método de Lowry et al. (1951). Para efectuar a referida análise prepararam-se três soluções:

• Solução A – Solução aquosa de tartarato de sódio e potássio a 7 mM, carbonato de sódio a 35 mM e NaOH a 0,5 M.

• Solução B - Solução aquosa de tartarato de sódio e potássio a 7 mM, sulfato de cobre a 40 mM e NaOH a 0,1 M.

• Solução C – Reagente de Folin e Ciocalteau’s diluído em água milli-Q na proporção 1:15.

Para a quantificação da concentração de proteínas foi efectuada uma recta de calibração, utilizando BSA (serum de albumina de bovino, Sigma) como padrão, a diferentes concentrações (0,02; 0,04; 0,1; 0,2 e 0,4 mg/ml).

De seguida pipetam-se para tubos de ensaio, em triplicado, 250 µl dos padrões e 250 µl de água Milli-Q (branco de água), 250 µl de amostra diluída 1:50 ou 1:100 e 250 µl do tampão microssomal (branco da amostra), diluída da mesma forma que a amostra. Adiciona-se a cada tubo 230 µl de solução A, colocam-se os tubos em banho-maria a 50ºC durante 10 minutos. Seguidamente, adiciona-se a cada tubo 50 µl de solução B e deixa-se repousar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Adiciona-se depois 750 µl de solução C a cada um dos tubos, que se colocam posteriormente a 50 ºC durante 10 minutos. Após arrefecimento à temperatura ambiente, a concentração das proteínas foi determinada por espectrofotometria de absorção a um comprimento de onda de 650 nm.