ANÁLISES QUANTITATIVAS DE PROTEÍNAS TOTAIS, AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS E AMIDO EM CALOS DE Cedrela

fissilis

4.6.1 Efeito de diferentes concentrações de sacarose e de glutamina em relação ao conteúdo de metabólitos primários e secundários de calos de Cedrela fissilis

Segmentos nodais cotiledonares medindo aproximadamente 5 mm de comprimento foram excisados de plântulas axênicas de C. fissilis com 8 semanas de idade [(Figura 6 –(A)-d)], obtidas conforme citado no item 4.4, e inoculados em meio de cultura preparado conforme descrito

no item 4.3, suplementado com 59 mM ou 118 mM de sacarose, com 2,5 M de BAP, 5 M de ANA. Para testar os efeitos da glutamina foram observados através da suplementação do meio com 0, 2,73 mM ou 5,46 de glutamina. As culturas foram mantidas nas condições descritas no item 4.4. Após 8 semanas do início dos experimentos os calos foram coletados para as análises dos metabólitos primários e secundários e para a análise da porcentagem de calogênese. Foram utilizadas no mínimo 20 repetições por tratamento para as análises, totalizando 6 tratamentos.

4.6.2 Efeito de diferentes fontes de carbono e das concentrações de BAP e ANA em relação ao conteúdo de metabólitos primários e secundários de calos de Cedrela fissilis

Segmentos nodais cotiledonares medindo aproximadamente 5 mm de comprimento foram excisados de plântulas axênicas de C. fissilis com 8 semanas de idade, obtidas conforme citado no item 4.4. Os nós cotiledonares, contendo duas gemas axilares cada, foram inoculados no meio de cultura descrito em 4.3, suplementado com 118 mM de sacarose, frutose ou glucose, 2,73 mM de glutamina e os reguladores de crescimento BAP nas concentrações de 2,5 e 5,0 µM em combinação com concentrações de 2,5 e 5,0 M de ANA. As culturas foram mantidas nas condições descritas no item 4.4. Após 8 semanas do início dos experimentos os calos foram coletados para as análises dos metabólitos primários e secundários e para a análise da porcentagem de calogênese. Foram utilizadas no mínimo 20 repetições por tratamento para as análises, totalizando 12 tratamentos.

4.6.3 Efeito de diferentes explantes, fontes de carbono, presença e ausência de luz e da glutamina sobre o crescimento e acúmulo de metabólitos primários e secundários em calos de Cedrela fissilis

Segmentos de raiz, hipocótilo, nó cotiledonar, nó foliar, cotilédone, folha e epicótilo medindo aproximadamente 5 mm de comprimento foram excisados de plântulas axênicas de C. fissilis com 8 semanas de idade obtidas conforme citado no item 4.4, e inoculados em meio de cultura preparado conforme descrito no item 4.3, suplementado com 118 mM de sacarose, frutose ou glucose, 0 ou 2,73 µM de glutamina, presença ou ausência de luz em 2,5 M de BAP, 5 M de ANA. Foram inoculados 2 segmentos por tubo de ensaio de raiz, hipocótilo, nó cotiledonar, nó foliar, cotilédone e folha e 1 segmento por

tubo de ensaio de epicótilo, sendo que cada tratamento foi constituído de 25 repetições por tratamento, totalizando 84 tratamentos. As culturas foram mantidas nas condições descritas no item 4.4 e no tratamento de escuro os tubos de ensaio contendo os explantes foram envoltos em papel alumínio. Após 8 semanas do início dos experimentos, foi avaliada a porcentagem de indução de calos (nº total de calos/nº total de explantes x 100%). Os calos provenientes dos tratamentos foram cortados e homogeneizados, e posteriormente foram mantidos a -80°C para análise de compostos do metabolismo primário e secundário. 4.6.4 Preparo das amostras e relação massa fresca/ massa seca

O extrato para a quantificação dos compostos foi preparado a partir de 1 g (massa fresca) para 8 mL de solvente extrator (metabólitos primários) e 10 mL de solvente extrator (metabólitos secundários). A concentração do extrato corresponde a 100 mg de extrato fresco (equivale a10 mg de extrato seco). As análises dos conteúdos de proteínas solúveis totais, açúcares solúveis totais, amido, carotenoides, compostos fenólicos, flavonoides, clorofila e a atividade antioxidante pela inibição do radical (DPPH) foram realizadas a partir de n=5.

Para a obtenção da relação massa fresca/massa seca (MF/MS), o teor de água dos calos foi expresso em porcentagem da massa fresca e em mg de água por mg de massa seca, determinados através da seguinte fórmula (LAUDANO, 2005):

Teor de água (% da massa fresca) = (massa fresca – massa seca) /massa fresca x 100.

4.6.4.1 Proteínas Solúveis totais:

Os extratos foram preparadas segundo Santos et al., (2010), com modificações. Os calos crescidos conforme descrito nos itens 4.6.1; 4.6.2; 4.6.3 foram maceradas em 8 mL de água, permanecendo em repouso por 30 minutos. Em seguida, o macerado foi aquecido em banho-maria a 40º C por 30 minutos, sendo transferidos para tubos Falcon, onde foram centrifugadas por 20 minutos, a 4.000 g. Para a quantificação das proteínas solúveis totais, alíquotas de 0,02 mL deste extrato, foram adicionadas a 0,2 mL do reagente de Bradford (1976). Após 20 min, procedeu-se a leitura das amostras a 595 nm em leitor de microplacas. A quantificação das proteínas solúveis totais foi feita a partir da curva padrão de albumina de soro bovino (BSA) (10 a 250 mg.

L-1- r² = 0,99; y =0,0027x). Os resultados foram expressos em mg de BSA por g de massa seca.

4.6.4.2 Açúcares solúveis totais (AST)

A metodologia descrita por Yemm & Willis (1954) foi utilizada para determinar o teor de açúcares solúveis totais (AST). Dos extratos de calos que foram preparados no item 4.6.4.1 (4.6.1; 4.6.2; 4.6.3) foram retiradasalíquotas de 0,02 mL, sendo adicionados a 0,98 mL de água destilada e 2 mL do reagente antrona ( 20 mg de antrona, 0,5 mL de água destilada e 10 mL de ácido sulfúrico concentrado) em tubos de ensaio, sendo agitados em vórtex e aquecidos em banho-maria a 100º C por 5 minutos. Após, procedeu-se a leitura das amostras a 620 nm em leitor de microplacas. A quantificação dos AST foi feita a partir da curva padrão de glucose (1 a 10 mg. mL-1- r²= 0,99; y = 0,340x). Os resultados foram expressos em mg de glucose por g de massa seca. 4.6.4.3 Amido

A metodologia descrita por Yemm & Willis (1954), foi utilizada para determinar o teor de amido. Ao resíduo da centrifugação do extrato bruto estabelecido conforme o item 4.6.4.1 (4.6.1; 4.6.2; 4.6.3), foram adicionados 2 mL de ácido perclórico 30 % (v/v), que permaneceu em repouso por 1 hora. Deste extrato, foi coletado 0,02 mL, sendo acrescido 0,98 mL de água destilada e 2 mL do reagente antrona. Coletou-se 0,02 mL deste resíduo, sendo adicionados 0,98 mL de água destilada e 2 mL do reagente antrona. Esta solução foi agitada em vórtex e aquecida em banho-maria a 100 º C por 5 minutos. Após, procedeu-se a leitura das amostras a 620 nm em leitor de microplacas. A quantificação do teor de amido foi feita a partir da curva padrão de glucose (1 a 10 mg. mL-1- r²= 0,99; y = 0,340x). Os resultados foram expressos em mg de glucose por g de massa seca.

4.7 ANÁLISES QUANTITATIVAS DE FENÓLICOS TOTAIS,