Aspectos relativos à gestação equina

3.3.1. Reconhecimento materno da gestação

Entende-se como “reconhecimento materno da gestação”, as diferentes estratégias empregadas pelas espécies domésticas para garantir a manutenção da vida embrionária e a função secretória do corpo lúteo, de forma a manter o útero em seu estado progestacional para suportar a gestação (Short, 1969).

Em éguas, assim como observa-se em outras espécies, a fertilização ocorre na ampola da tuba uterina (Steffenhagen et al., 1972). Segundo Battut et al. (1998) a entrada do oócito fertilizado no útero se dá por volta de 144 a 168 horas após a ovulação. Neste sentido, Freeman (1992) e Weber (1995) demonstraram que ao alcançar o estágio de mórula compacta, no quinto dia de seu desenvolvimento, o embrião começa a secretar quantidades significativas de prostaglandina E2 (PGE2), cuja função local é relaxar a musculatura lisa circular da tuba. A partir desse evento, ocorre a entrada do embrião no útero em aproximadamente 24 horas.

O embrião se torna um blastocisto no momento ou logo após adentrar o corno uterino, no sexto dia após a ovulação (Betteridge et al., 1982). O termo blastocisto é usado quando uma cavidade central se forma (a blastocele), ficando a massa celular interna (MCI) estabilizada em um pólo. É formado pelas camadas ectoderma, mesoderma, endoderma e cápsula, sendo esta última de ocorrência exclusiva na espécie equina. A MCI irá formar o disco embrionário a partir do qual se formará o corpo do embrião. A membrana que envolve o blastocisto é uma camada única de células ectodérmicas denominadas trofoblasto, que origina o córion, futuro componente fetal da placenta.

A cápsula do blastocisto, resistente e de natureza glicoproteica, desenvolve-se entre o trofoblasto e a zona pelúcida e envolve o embrião entre os dias 6,5 a 22 (Betteridge, 1989), durante os processos de migração, fixação e orientação embrionária. Aditivamente, ela tem a função de regular o suprimento de nutrientes para o embrião. Em função da sua carga eletrostática negativa e de sua configuração em glicocálix (Oriol et al., 1993), a superfície externa da cápsula é um local de aderência de uma série de proteínas e componentes das secreções das glândulas endometriais, durante a movimentação do embrião pelo útero. Tal fato resulta no aumento do peso da cápsula entre a expansão do blastocisto nos dias 7 e 8 e a sua imobilização, aos 17 dias pós- ovulação (Oriol et al., 1993a). Por volta do dia 21 a cápsula começa a desintegrar-se (Enders et al., 1991), em consequência, provavelmente, da ação de enzimas proteolíticas secretadas pelo trofoblasto e/ou pelo epitélio endometrial (Denker et al., 1987), permitindo a aderência física do concepto ao endométrio.

Envolto pela cápsula glicoproteica, o embrião equino é impossibilitado de se rearranjar e se alongar entre os dias 10 e 14 pós-ovulação como ocorre em suínos e nos ruminantes, a fim de permitir um contato íntimo do trofoblasto com uma área razoável do endométrio, no corno uterino gravídico (Wooding et al., 1982). Diferentemente, na espécie equina, o embrião permanece esférico e completamente livre, movendo-se continuamente por todo o útero, propelido por fortes contrações peristálticas do miométrio (Ginther, 1983ab, 1985), induzidas por liberações rítmicas de PGF2α e PGE2 produzidas pelo embrião (Stout e Allen, 2001a). Estudos sugerem que o embrião alcança o corpo uterino no dia oito (Griffin et al., 1993), quando inicia o processo de migração transuterina, que persiste até os dias 15 a 17 (Ginther et al., 1983b; Leith e Ginther, 1984). A seguir, diante de um repentino aumento do tônus

miometrial, fixa-se no eventual local de implantação, na base de um dos cornos uterinos (van Niekerk, 1965; Ginther, 1983b).

Dentre os prováveis fatores estimuladores do útero produzidos pelo embrião, estariam incluídos o estrógeno, a progesterona, a prostaglandina F2alfa (PGF2α) e a prostaglandina E2 (PGE2). O estímulo de origem embrionária parece ter meia-vida curta. Assim, verificou-se que a contratilidade uterina no corpo do útero, decresceu gradativamente após a vesícula ter saído deste local, durante um período de avaliação de uma hora (Griffin et al., 1993). Algumas substâncias são secretadas pelo concepto durante o período de mobilidade, tais como estrógenos (Zavy et al., 1979), prostaglandinas (Watson e Sertich, 1989), e vários polipeptídeos (Fazleabas et al., 1983). As prostaglandinas parecem estar mais relacionadas com o estímulo para as contrações uterinas.

O fenômeno da migração transuterina é uma adaptação evolucionária que garante ao embrião o sinal de reconhecimento materno por toda a extensão do útero (Allen, 2000), garantindo a luteostase necessária para a manutenção da gestação (Ginther, 1983b; Sharp, 2000; Stout e Allen, 2001). A restrição cirúrgica do embrião equino em um terço da área total uterina é seguida por luteólise e um retorno ao cio no período esperado do ciclo estral (Allen, 2000; Sharp, 2000). Além de essencial para o reconhecimento materno da gestação, a migração transuterina permite ao concepto utilizar mais efetivamente as secreções endometriais, que constituem a única fonte de nutrientes antes da formação da placenta definitiva (Ginther et al.,1985).

A fixação é definida como a cessação da mobilidade embrionária (Ginther et al, 1983b) e ocorre aproximadamente no 15º dia em pôneis e no 16º em éguas (Ginther et al., 1985). O embrião se fixa usualmente próximo à flexura uterina na porção caudal

de um dos cornos (Ginther et al., 1983b). Foi postulado que apesar das contrações uterinas, a fixação embrionária ocorre neste local, em virtude de ser a flexura o melhor local de impedimento intraluminal à mobilidade embrionária (Ginther et al., 1995).

A orientação é o processo no qual ocorre a rotação da vesícula embrionária para uma posição ventral, oposta à implantação mesometrial. É um processo importante no momento da transição entre o saco vitelino e a alantoide e na formação do cordão umbilical. Os mecanismos envolvidos na orientação da vesícula embrionária dentro do lumen uterino, em animais de grande porte, ainda não estão completamente elucidados. Na espécie equina, tem sido postulado que o processo ocorre entre os dias 16 a 21 de gestação (Ginther et al., 1998).

A natureza do sinal através do qual o concepto equino informa bioquimicamente à égua a sua presença, de forma a evitar a luteólise, ainda não está esclarecida. Nos ruminantes, ocorre a síntese e liberação de grandes quantidades de um hormônio proteico, o interferon tau (IFN-τ) pelo trofoblasto do embrião entre os dias 10 e 16 após a ovulação, visando suprimir o desenvolvimento de receptores de ocitocina no endométrio (Lamming et al., 1995). Esse mecanismo previne que a ocitocina secretada pelo corpo lúteo se ligue aos receptores endometriais e inicie a liberação pulsátil de PGF2α, com a consequente luteólise. Ainda não se sabe se há produção de uma molécula do tipo interferon pelo embrião equino, com propriedades confirmadamente luteostáticas (Baker et al., 1991). Entretanto, estudos recentes verificaram que o embrião equino expressa genes para o interferon-delta, o qual pode estar envolvido na prevenção da luteólise (Cochet et al., 2009), similarmente ao interferon-tau dos ruminantes (Roberts et al., 2008).

Similarmente ao embrião suíno, o embrião equino começa a secretar estrógeno desde os sete dias pós-ovulação, acreditando-se, inicialmente que essa seria a substância responsável pela sinalização embrionária ao útero materno (Allen, 2000; Allen, 2001; Raeside et al., 2002, 2004; Hafez e Hafez, 2004). Embora o estrógeno sozinho não seja o responsável pela sinalização materna da gestação em equinos, ele parece estar envolvido. Altas concentrações de estrógeno, associadas ao aumento da progesterona levam a um aumento considerável da produção de uteroferrinas (Ellenberger et al., 2008), podendo ser estas proteínas responsáveis pelo reconhecimeno materno da gestação (Sharp, 2000).

O entendimento das interações moleculares que ocorrem entre o concepto e o endométrio é de extrema importância, haja vista as altas taxas de morte embrionária nesse período. Supõe-se que o embrião envie sinais de sua presença no período compreendido entre sua chegada ao útero e a fixação do mesmo, na base de um dos cornos uterinos (ou seja, entre os dias 7 a 17). É provável que o sucesso no estabelecimento e manutenção da gestação na égua envolva uma combinação de diferentes eventos sinalizadores, como parte de um permanente “diálogo” materno-fetal. 3.3.2. Endocrinologia da égua gestante

3.3.2.1. Gonadotrofina coriônica equina (eCG)

Em 1930, Cole e Hart demonstraram que em ratas impúberes, a aplicação intraperitoneal de soro obtido de éguas gestantes, estimulava o crescimento ovariano. Os autores coletaram soro sanguíneo de 64

éguas em diferentes etapas da gestação e perceberam que o soro coletado antes do 37° dia não produzia efeitos gonadais nas ratas. O estímulo máximo foi observado quando o soro era proveniente de éguas entre 43 e 80 dias de gestação, havendo um estímulo mínimo quando coletado após os 210 dias de gestação. À esta substância presente no soro de éguas gestantes com efeito estimulador dos ovários, deu-se o nome de gonadotrofina sérica da égua gestante (PMSG).

Inicialmente, acreditava-se ser a PMSG produzida pela hipófise, o que foi contradito mais tarde pela comprovação da origem fetal desta glicoproteína, produzida pelas células da cinta coriônica que invadem o endométrio formando os cálices endometriais (Allen e Moor, 1972). Pela sua origem trofoblástica, a substância passou a ser denominada gonadotrofina coriônica equina (eCG).

Em relação à outros hormônios gonadotróficos, a eCG apresenta a singularidade de possuir atividade folículo estimulante (FSH) e luteizante (LH) na mesma molécula (Papkoff, 1974; Stewart et al., 1976). Devido à estas propriedades, tem sido utilizada para a manipulação do ciclo estral e indução de superovulação em várias espécies de importância econômica, principalmente em ovinos e suínos.

A gonadotrofina coriônica foi purificada tanto na égua quanto na jumenta (Clegg et al., 1982), podendo ser encontrada em híbridos destas duas espécies. Entretanto, sua sequência de aminoácidos não é idêntica entre as duas. Assim, este hormônio é denominado segundo a espécie que a produziu. Portanto, quando oriunda de éguas, denomina-se gonadotrofina coriônica equina (eCG), e quando oriunda de jumentas, gonadotrofina coriônica de jumenta (jCG).

3.3.2.1.1. Formação e destruição dos cálices endometriais

Muitas das alterações endocrinológicas ocorridas durante a gestação na égua parecem ser exclusivas ao gênero Equus. Um fato bastante importante é o desenvolvimento, função, manutenção e finalmente destruição dos cálices endometriais, que são estruturas transitórias produtoras da gonadotrofina coriônica equina (eCG) (Allen, 1969; Allen, 1975a; Ginther, 1992; de Mestre et al., 2008). Após a ovulação, o corpo lúteo primário passa a produzir progesterona. Na égua gestante, esta produção atinge concentrações plasmáticas de 6 a 10 ng/mL no 5° dia após a ovulação, que continuam a elevar-se até os dias 35 a 40, quando a eCG começa a ser produzida pelos cálices endometriais (Lunn et al., 1997; Allen et al., 2002b).

A égua possui uma placenta do tipo epitéliocorial, que representa a forma menos invasiva de placentação dentre as espécies domésticas (Lunn et al., 1997). No entanto, uma subpopulação de células trofoblásticas altamente invasivas se diferencia entre os dias 25 e 36 de gestação para formar uma faixa avascular composta por tecido altamente compacto, que circunda o concepto esférico na região entre o alantoide em formação e o saco vitelínico em regressão (Ginther, 1992; Lunn et al., 1997; Adams e Antczak, 2001; Wooding et al., 2001; de Mestre et al., 2008). Esta cinta coriônica (van Niekerk, 1965) é formada por células binucleadas hiperplásicas, que se multiplicam e adquirem movimento ameboide por volta dos dias 36 a 38. Neste período, ao contrário das demais células trofoblásticas não invasivas, as células da cinta coriônica se desprendem do córion e invadem o endométrio materno (Allen e Moor, 1972; Lunn et al., 1997; Wooding et al., 2001), passando pelas células do epitélio luminal até alcançar a membrana basal (Allen et al., 1973).

No endométrio materno, as células binucleadas da cinta coriônica secretam proteinases, que auxiliam no ataque à matriz extracelular, e consequentemente na sua inserção no endométrio (Vagnoni et al., 1995; Roser, 1999). Durante a invasão, estas células sequestram e fagocitam as células epiteliais rompidas e desorganizadas (Ginther, 1992). A migração persiste até alcançarem as glândulas endometriais, onde iniciam a secreção de eCG, e proliferam até formar estruturas macroscópicas. Tais protuberâncias, descritas originalmente por Schauder (1912) e denominadas cálices endometriais por Cole e Goss (1943), são vistas por volta do dia 40 de gestação, como uma série de placas esbranquiçadas na superfície do endométrio, organizadas ao redor do concepto, na base do corno uterino gravídico (Clegg et al., 1954; Allen, 1975; Ginther, 1992; Lunn et al., 1997; Adams e Antczak, 2001).

Segundo Ginther (1992), a formação histológica das células do cálice endometrial pode ser dividida em cinco fases: fixação, invasão, fagocitose, migração e diferenciação. A cinta coriônica inicialmente consiste em um envoltório raso que vai se alongando como estruturas vilosas, por volta do dia 33 de gestação (de Mestre et al., 2008). A fixação ocorre no dia 37 e consiste numa ligação entre as interdigitações da superfície das células coriônicas alongadas com as criptas correspondentes do epitélio endometrial. As células trofoblásticas invadem o endométrio para a penetração do citoplasma nas células epiteliais (Allen, 1982).

Quando a invasão é concluída, as células não invasivas da cinta coriônica sofrem necrose. As células invasivas começam a sofrer uma série de mudanças morfológicas e funcionais: perdem a habilidade de migrar, adquirem contorno mais circular e hipertrofiam significativamente (Allen, 1982). O citoplasma se torna mais pálido e um segundo núcleo eucromático se desenvolve, resultando na típica célula de

cálice madura (Allen, 1982). As mesmas mudanças morfológicas são observadas em células coriônicas cultivadas in vitro (Allen e Moor, 1972), e parecem estar associadas ao início da secreção de eCG e à perda da habilidade mitótica (Allen, 1982). O epitélio endometrial invadido é destruído, porém se regenera rapidamente e recobre a face luminal dos cálices endometriais por volta do dia 45, deixando este tecido completamente separado da placenta (Lunn et al., 1997).

A porção apical das glândulas endometriais, na área onde se formaram os cálices, fica obstruída; no entanto, as suas porções basais permanecem intactas, aumentando de tamanho e se distendendo progressivamente, em função da proliferação das células e do acúmulo de suas secreções. No interior de cada glândula acumula-se grande quantidade de carboidratos, que se depositam na superfície dos cálices endometriais até por volta do dia 70 de gestação (Stewart et al., 1995; Roser, 1999).

Poucos vasos sanguíneos permanecem no tecido dos cálices, embora vasos linfáticos sinuosos se desenvolvam no estroma endometrial sob os mesmos, sendo a eCG secretada por esta via até alcançar a circulação materna (Amoroso, 1952). A capacidade de secreção hormonal das células dos cálices, é máxima entre os dias 55 e 70 de gestação, período em que os mesmos são vistos como estruturas circulares esbranquiçadas, com 3 a 5 cm de diâmetro, distribuídas na superfície do endométrio, na base do corno uterino gestante (Allen, 1982; Stewart et al., 1995; Roser, 1999). O desenvolvimento dos cálices endometriais e a quantidade de eCG que secretam, dependem, dentre outros fatores, da configuração do endométrio no momento da invasão pela cinta coriônica (Allen, 2000), do genótipo do embrião e da compatibilidade entre os tecidos embrionários e maternos (Knobil e Neil, 1998).

Durante a invasão das células da cinta coriônica no endométrio, as células com composição genética diferente da materna provocam uma reação inflamatória na égua. Por volta dos dias 36 a 38, quando se inicia a invasão, um grande número de linfócitos se acumula no estroma subepitelial do endométrio. Enquanto as células da cinta coriônica formam os cálices endometriais, os linfócitos desaparecem, retornando em grande número por volta do dia 50 de gestação (Allen et al., 1993). Entre os dias 60 e 80, os cálices endometriais apresentam intensa atividade, mesmo com a imunidade celular, composta em sua maioria por linfócitos CD4+ e CD8+ (Kydd et al., 1991), macrófagos e eosinófilos (Grünig et al., 1995). Os linfócitos formam uma massa celular separando cada cálice endometrial do tecido materno adjacente (Allen, 1982). Esta reação imunológica materna é induzida pela expressão de antígenos paternos do complexo de histocompatibilidade maior tipo I (MHC-I) pelas células invasivas da cinta coriônica. Estes antígenos estimulam uma forte resposta humoral por parte da mãe, que os reconhece como não próprios. A resposta imunológica parece ocorrer de maneira similar em todas as éguas, incluindo as primíparas (Donaldson et al., 1990). Os anticorpos persistem por todo o período gestacional, sendo que a sua concentração sérica aumenta marcadamente durante as etapas iniciais da gestação.

A partir dos 80 a 90 dias de gestação, ocorre a regressão dos cálices endometriais, associada a uma intensa resposta leucocitária materna (Lunn et al., 1997; Sharp, 2000; Adams e Antczak, 2001; Wooding et al., 2001). Em uma gestação resultante do cruzamento intraespécie de equinos, a reação imune destroi completamente os cálices endometriais até os dias 140 a 160, sem afetar a placenta ou o feto (Allen et al., 1973; Allen, 1993; Stewart et al., 1995). O processo de destruição resulta da necrose de todo o cálice, de forma que nos dias 120 a 150, o tecido necrótico e as secreções

aderidas a ele, desprendem-se da superfície do endométrio para o lúmen uterino. Os cálices necróticos situados na região dorsal do corno uterino gravídico se insinuam no alantocórion dando origem a estruturas pedunculadas que se projetam para o interior da cavidade alantoidiana, as denominadas bolsas alantocoriônicas (Lunn et al.,1997; Allen, 2000).

A resposta imune humoral e celular materna produzida contra os antígenos de histocompatibilidade do embrião equino não compromete a gestação, uma vez que nem a placenta nem o feto são afetados (Allen et al., 1973; Allen, 1993; Roser et al., 1999). Tal condição pode ser explicada pela reação imune se restringir aos cálices endometriais, apesar de que antígenos paternos MHC-I estão presentes tanto na placenta quanto no embrião. Adams e Antczak (2001) demonstraram que o trofoblasto consegue desviar a resposta imune materna, sugerindo um mecanismo imunomodulador durante a gestação, que impede a destruição do embrião. Na maioria das espécies, incluindo a equina, o trofoblasto não expressa antígenos MHC-I e MHC-II, o que dificulta o seu ataque pelo sistema imune (Allen, 1982; Allen et al., 1993; Stewart et al., 1995).

3.3.2.1.1.1. Efeito do genótipo fetal no desenvolvimento dos cálices endometriais

Estudos conduzidos ao longo dos anos envolvendo gestações inter e intraespécies de equídeos, demonstraram que o genótipo fetal e o ambiente uterino exercem grande influência no desenvolvimento dos cálices endometriais, e por consequência na secreção de eCG. Isso está relacionado ao grau de desenvolvimento e a capacidade de invasão da cinta coriônica do embrião (Bielanski et al., 1956; Clegg et al., 1962; Allen, 1969, 1975, 1982a; Allen et al.,1987, 1993).

Em uma gestação intraespécie de equinos, os cálices endometriais produzem eCG e estimulam a função lútea a partir dos 35 a 40 dias de gestação, produzindo altas concentrações desse hormônio (20-300 UI/ml) até os dias 120 a 150, quando os cálices são destruídos pelo sistema imune materno. Em algumas éguas a secreção de eCG chega a se prolongar além do dia 150 da gestação (Stewart et al., 1995).

Por outro lado, gestações híbridas entre diferentes espécies de equídeos, produzem alterações que resultam em importantes diferenças na formação, manutenção e destruição dos cálices endometriais. Assim, éguas gestantes de embriões muares exibem concentrações séricas de eCG de seis a dez vezes menores que as éguas gestando embriões equinos. Além disso, o período de secreção da eCG é mais curto, sendo que o hormônio se torna indetectável na corrente sanguínea antes dos 80 dias de gestação (Boeta e Zarco, 2005; Acosta, 2008). Entretanto, jumentas gestantes de embriões bardotos (jumenta x cavalo) apresentam concentrações séricas de jCG , cinco a oito vezes superior à produzida quando gestam embriões asininos, sendo que a atividade gonadotrófica persiste até por volta dos 120 dias de gestação (Allen, 1982).

Quando de um cruzamento interespécie de uma égua com um jumento, os cálices endometriais que se formam das células coriônicas do embrião muar são destruídos muito rapidamente, entre os 50 a 80 dias de gestação, sendo que as concentrações de eCG sofrem uma redução prematuramente ou nem sequer chegam a elevar-se (Allen et al., 1993b). Tal condição parece dever-se à uma resposta muito eficiente do sistema imune da égua contra os antígenos de histocompatibilidade do jumento, expressos pelas células coriônicas do embrião híbrido. Assim, há um acúmulo de linfócitos ao redor dos cálices endometriais muito maior nestas gestações do que observa-se em gestações intraespécies (Allen, 1982).

A cinta coriônica que se desenvolve em um embrião muar é mais estreita e menos compacta quando comparada com a camada espessa e densa que se forma ao redor de um concepto equino. Consequentemente, menos células da cinta coriônica podem invadir o endométrio, de forma que os cálices endometriais formados serão inevitavelmente menores e menos desenvolvidos (Allen, 1982). Por outro lado, em gestações de embriões bardotos, desenvolve-se uma cinta coriônica espessa e larga, maior que a formada em uma gestação intraespécie de um embrião asinino. Consequentemente, os cálices endometriais formados são maiores e mais ativos, produzindo concentrações séricas elevadas de eCG (Allen, 1982; Allen et al., 1993b). Outra característica observada nas gestações híbridas de equídeos é a resposta leucocitária materna, que se apresenta mais precoce e agressiva. Allen (1975c), estudando o processo em gestações intraespécies de equinos, observou o aparecimento de poucos linfócitos logo após a invasão das células da cinta coriônica, por volta do 38° dia de gestação. A partir desse momento, houve um aumento lento e