2 MATERIAL E METODOS
3.1 Coloração convencional
O número cromossômico diploide 2n = 18 foi verificado nas espécies genitoras, P.
coccinea e P. hatschbachii e nos 16 híbridos interespecíficos HD25 (Figura 2). Através
da coloração convencional não possível realizar a identificação dos pares cromossômicos homeólogos, pois a identificação precisa de satélites ou distinção na posição de centrômeros entre pares foi impossibilitada, sendo possível a verificação em poucas metáfases. Desta forma as medições foram realizadas em todo o cromossomo, incluindo braço curto, braço longo e satélite (comprimento total) e a partir destas medições foram produzidos os ideogramas (Figuras 8 e 9), com base na média do comprimento total dos cromossomos das cinco metáfases dos 18 cromossomos para os híbridos e com base nas medidas do comprimento total dos pares cromossômicos para os genitores.
138
Figura 2.Metáfases mitóticas em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora
(2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E)
HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245. Barra 10 μm.
139
3.2 Bandamento CMA3 e DAPI
A análise com os fluorocromos CMA3/DAPI possibilitou a visualização de heterocromatina rica em GC, cuja região corresponde aos satélites (constrição
secundária). Os genitores, P. coccinea e P. hatschbachii, apresentaram dois pares de
cromossomos com blocos CMA3+/DAPI- (Figuras 3 A e B). Em todos os híbridos F1 foi
possível a observação de blocos CMA3+, confirmando o número de satélites igual aos
dos genitores (Figura 3, 4, 8 e 9; Tabela 1).
Os cariogramas dos genitores foram elaborados levando em consideração o tamanho cromossômico, seguindo a ordem decrescente. A elaboração dos cariogramas dos híbridos foi com base nos cromossomos homeólogos e não no tamanho cromossômico, sendo que a disposição dos cromossomos não seguiu a ordem decrescente. Foi realizada a identificação dos cromossomos no cariótipo dos genitores a
partir de letras e números. Para o genitor materno, P. coccinea, foi designado para os
pares cromossômicos de 1 a 9, os cromossomos de 1A a 9I (Figura 4A). Para o genitor
paterno, P. hatschbachii, foi denominado de 1a a 9i para os pares cromossômicos de 1 a
9 (Figura 4B). Para os genótipos híbridos a denominação no cariótipo foi com base nos
cromossomos marcadores dos genitores, com a presença dos blocos CMA3+ com
segregação nos híbridos. Os pares cromossômicos 5E e 8H do genitor P. coccinea
apresentaram os blocos CMA3+ (Figura 4A) e os pares cromossômicos 3c e 8h do
genitor P. hatschbachii apresentaram os blocos CMA3+ (Figura 4B).
Os 16 híbridos analisados foram numerados e nomeados apresentando os blocos
CMA3+ como marcadores para a identificação. Foi escolhido como marcador o
cromossomo 5E e 3c dos genitores P. coccinea e P. hatschbachii, respectivamente,
ambos nos braços longos, uma vez que esses cromossomos apresentaram marcas exclusivas para cada genitor na confirmação do status híbrido dos genótipos. Neste sentido, em todas as plantas híbridas foram identificados os cromossomos com blocos
140
Figura 3. Coloração com fluorocromos utilizando CMA3 e DAPI para localização de
heterocromatina em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A)
P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F)
HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q)
141
Figura 4. Cariogramas das metáfases mitóticas com bandamento CMA3/DAPI em
genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P.
hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25
133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245. As letras e números nos genitores indicam os pares cromossômicos. As letras e
números nos híbridos indicam os cromossomos com os blocos CMA3+. Barra 10 μm.
3.3 GISH
A GISH utilizando as sondas dos genitores concomitantemente e sem o uso de DNA de bloqueio na mistura de hibridação permitiu a distinção dos genomas de cada genitor nos 16 híbridos (Figura 5), comprovando o caráter híbrido das plantas F1 em estudo. Em cada híbrido foi visualizado nove cromossomos hibridados uniformemente com a sonda do genitor paterno, detectados com avidina-FITC (verde) e os nove cromossomos hibridados com a sonda do genitor materno, detectados com antidigoxigenina-rodamina (vermelho).
142
Figura 5. Hibridização Genômica In Situ (GISH) em metáfases mitóticas dos híbridos
interespecíficos obtidos do cruzamento entre P. coccinea (cromossomos vermelhos) e P.
hatschbachii (cromossomos verdes). (A) HD25 101, (B) HD25 106, (C) HD25 109, (D)
HD25 125, (E) HD25 133, (F) HD25 140, (G) HD25 143, (H) HD25 156, (I) HD25 187, (J) HD25 190, (K) HD25 218, (L) HD25 224, (M) HD25 237, (N) HD25 238, (O) HD25 244, (P) HD25 245. Barra 10 μm.
3.4 FISH
Foram mapeados os cromossomos dos genitores e os híbridos refrentes aos sítios de DNA Sat (colocalizado com sítios de DNAr 45S) e DNAr 5S (Figuras 6 - 9). Através da FISH utilizando a sonda de DNA Sat foi possível identificar os satélites (constrição secundária) não visualizados na coloração convencional. Foram observados quatro sítios de DNA Sat e dois sítios de DNAr 5S em ambos os genitores que segregaram nos genótipos híbridos (Tabela 1 e Figuras 6 - 9).
143
Os cariogramas dos genitores e híbridos com os sítios de hibridação de DNA Sat e DNAr 5S foram elaborados seguindo o procedimento para a elaboração dos cariogramas
refente aos blocos CMA3+, sendo identificado os cromossomos no cariótipo dos
genitores a partir de letras e números. A identificação nos genótipos híbridos foi realizada com base nos cromossomos marcadores dos genitores, com sítos de hibridação de DNA Sat e DNAr 5S, os quais ocorrem nos híbridos. Portanto, os sítos de DNA Sat
em P. coccinea, foram observados nos pares cromossômicos 5E e 8H e os sítios de
DNAr 5S localizados no par 6F (Figura 7A). Em P. hatschbachii os pares
cromossômicos 3c e 8h apresetaram sítios de DNA Sat e o par 7g apresentou sítios de DNAr 5S (Figura 7B).
Os híbridos interespecíficos F1 apresentaram dois pares cromossômicos com sítios de hibridação de DNA Sat e um par com sítios de DNAr 5S, característica de cada genitor (Figuras 6 - 9; Tabela 1) confirmando que todos os genótipos analisados são híbridos.
Como objetivo de facilitar a identificação dos cromossomos marcadores, os cariogramas dos híbridos foram numerados e nomeados unicamente com os cromossomos marcadores, os quais revelaram os sítios de DNA Sat e DNAr 5S, (Figura
7C-R). Na espécie P. coccinea, o cromossomo 5E e 6F foram escolhidos como
marcadores, uma vez que foram exclusivos para a espécie (Figura 7A). O par 3c, em P.
hatschbachii, também confere como bom marcador cromossômico, na confirmação da
paternidade dos híbridos analisados, já que este marcador é exclusivo para a espécie, assim como o par cromossômico 7g (Figura 8B).
Quanto aos outros cromossomos com sítios de DNA Sat não foram utilizados como marcadores, pelo fato desses sítios estarem presentes no braço longo em ambos os genitores. Além disso esses cromossomos são morfologicamente semelhantes, o que impede a sua utilização de maneira confiável para a confirmação.
144
Figura 6. Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) com as sondas para sítios de DNAr 5S
(vermelho, indicado pelas setas) e DNA Satélite (sonda CL69 PeSat_2) (verde, indicado
pelas setas) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora (2n = 18). (A) P.
coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F) HD25
125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245. Barra 10 μm.
145
Figura 7. Cariogramas com sondas para sítios de DNAr 5S (vermelho) e DNA Satélite
(sonda CL69 PeSat_2) (verde) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de Passiflora
(2n = 18). (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E)
HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156, (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O) HD25 237, (P) HD25 238, (Q) HD25 244, (R) HD25 245. As letras e números nos genitores indicam os pares cromossômicos. As letras e números nos híbridos indicam os cromossomos com os sítios de DNAr 5S e DNA Satélite. Barra 10 μm.
146
Figura 8. Ideogramas evidenciando o bandamento CMA3 e sítios de DNAr 5S e DNA Sat (colocalizado com DNAr 45S) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de
Passiflora (2n = 18): (A) P. coccinea, (B) P. hatschbachii, (C) HD25 101, (D) HD25 106, (E) HD25 109, (F) HD25 125, (G) HD25 133, (H) HD25 140, (I) HD25 143, (J) HD25 156.
147
Figura 9. Ideogramas evidenciando o bandamento CMA3 e sítios de DNAr 5S e DNA Sat (colocalizado com DNAr 45S) em genitores e híbridos interespecíficos F1 de
Passiflora (2n = 18): (K) HD25 187, (L) HD25 190, (M) HD25 218, (N) HD25 224, (O)
148
Tabela 1. Dados de bandamento CMA3, DNA Sat, DNAr 5S dos genitores Passiflora
coccinea e P. hatschbachii e híbridos interespecíficos F1 (2n = 18).
Genótipos CMA3+ DNA Sat (colocalizado
com DNAr 45S) DNAr 5S
P. coccinea 4 4 2 P. hatschbachii 4 4 2 HD25 101 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 106 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 109 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 125 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 133 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 140 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 143 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 156 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 187 4 4 (2M; 2P) 2(1M; 1P) HD25 190 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 218 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 224 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 237 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 238 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 244 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P) HD25 245 4 4 (2M; 2P) 2 (1M; 1P)
Número de blocos CMA3 (CMA3+); número de sítios de DNA Sat (DNA Sat); número
de sítios 5S (DNAr 5S); sítio originado do genitor materno (M); sítio originado do genitor paterno (P).
4 DISCUSSÃO
Muitas espécies de Passiflora tendem a apresentar cariótipo semelhante, com a
maioria dos cromossomos metacêntricos e com tamanhos similares (SOUZA et al.,
2008). Sendo assim, híbridos F1 apresentam semelhanças cariotípicas, levando a
dificuldades no pareamento de cromossomos homeólogos. Nesse sentido, a caracterização cariotípica das plantas híbridas se torna uma tarefa difícil quando se deseja comparar com o cariótipo dos genitores, ficando limitada apenas na contagem do número cromossômico (SOARES-SCOTT et al., 2005). Em híbridos interespecíficos de
Passiflora, obtidos do cruzamento entre P. gardneri Mast. vs. P. gibertii N.E. BROW,
foi observado cariótipo similar tanto para as espécies genitoras quanto para os híbridos, dificultando a distinção baseado no tamanho cromossômico (SILVA, 2014).
Neste estudo, através da coloração convencional não foi possivel identificar a localização e o número de satélites (constrição secundária) nos genitores e híbridos, uma vez que era visualizados em poucas metáfases mitóticas e de maneira imprecisa. No entanto, através do bandamento CMA3, foi possível a identificação dos satélites de
149
forma segura. Em trabalhos anteriores através da coloração convencional, foi observado
a presença de dois pares com constrição secundária em P. coccinea e P. hatschbachii
(MELO et al., 2014; OLIVEIRA, 2017).
A identificação de blocos CMA3+nos genitores constitui-se em uma ferramenta
que proporciona resultados informativos e precisos, permitindo a confirmação de
híbridos (SILVA et al., 2017, in press). Em Passiflora, blocos heterocromáticos ricos
em GC visualizados pelo fluorocromo CMA3 colocalizam em regiões de DNAr 45S (MELO et al., 2014; BELO et al., 2015; SILVA et al., 2017 in press). Mais uma vez a
utilização do fluorocromo CMA3 mostra-se confiável quanto à localização de satélites
sendo importantes marcadores citológicos para identificação de híbridos
interespecíficos.
A GISH é bastante eficiente na discriminação de genomas das espécies genitoras nos híbridos, tendo como base sondas genômicas (SILVA; SOUZA 2013; SILVA et al., 2017 in press). Além disso, possibilita a identificação de recombinações cromossômicas de híbridos retrocruzados (MELO et al., 2015), na investigação das relações genômicas entre espécies (SILVA 2014) e no estudo da origem de genomas parentais de poliploides (LIU; GU et al., 2011). Neste estudo foi usada a sonda de ambos os genitores para confirmação da fecundação cruzada sendo observado a presença dos
genomas de P. coccinea e P. hatschbachii na composição genômica das plantas
híbridas.
Pelo fato das espécies genitoras pertencerem ao mesmo subgênero e secção, sendo próximas filogeneticamente e compartilhando muitas sequencias repetitivas, foi utilizada as sondas de ambos os genitores, visto que já foram observados resultados
positivos em híbridos F1 e retrocruzados de Passiflora (MELO et al., 2015). No
cruzamento artificial entre duas espécies de orquídeas (Paphiopedilum delenatii vs.
Paphiopedilum micranthum) também só foi possível à distinção dos genomas dos
genitores nos híbridos com a utilização das sondas de ambos os genitores, uma vez o genomas desses indivíduos apresentam relações filogenéticas próximas (LEE et al., 2011).
Para obtenção de resultados satisfatórios e confiáveis, muitas vezes é preciso o ajuste da técnica de GISH, como, a utilização de sondas genômicas dos genitores, modificações na concentração de DNA de bloqueio e sondas, bem como na melhor definição do tamanho dos fragmentos de DNA usados no preparo de DNA de bloqueio e sonda (SCHWARZACHER; HESLOP-HARRISON, 2000; MELO et al., 2015). O uso
150
de DNA de bloqueio 100x ou até 1000x mais concentrado que a sonda tem sido empregada na distinção do genoma dos genitores devido ao grau de homologia que elas podem apresentar (TANG et al., 2010; FRIENSEN; KLAAS, 1998), em função das muitas sequências repetitivas compartilhadas (SILVA et al., 2017 in press). Em híbridos
interespecíficos resultantes do cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii foi testado o
DNA de bloqueio do genitor materno 20x, 40x, 60x e 100x mais concentrado que o DNA do genitor paterno. Nesse estudo foi verificado que o DNA de bloqueio 100x mais concentrado que a sonda foi eficiente na distinção dos genomas dos genitores nos híbridos, evitando a hibridação cruzada (SILVA et al., 2017 in press).
A fluorescência amarela opaca visualizada nos cromossomos hibridados utilizando a sonda detectada pela anti-digoxigenina-rodamina (Figura 5) observada com o uso do mesmo filtro Olympus U-MWB (específico para a detecção FITC), foi devido a mistura de sinais FITC (verde) - TRITC (vermelho), pois os locais de hibridação fortes do TRITC são visualizados em uma mistura com os locais de hibridação FITC e a fluorescência TRITC transforma -se em amarela (MELO et al., 2015).
Outro fator a ser considerado na eficiência da aplicação da GISH, está relacionado
com o tamanho cromossômico. Em algumas espécies como Brassica rapa L., B. napus
L. (YAO et al., 2010) e em espécies do gênero Citrus (FU et al., 2004), já foi reportado
que cromossomos pequenos podem limitar a aplicação da técnica, sendo que em
Brassica apenas as regiões pericentroméricas podem ser hibridadas (YAO et al., 2010).
Contudo, em híbridos retrocruzados de Passiflora, a aplicação da GISH evidencia
resultados eficientes em cromossomos pequenos, não sendo impecilho na aplicação desta técnica (MELO et al., 2015).
O DNA Satélite (DNA Sat) colocalizam com o DNAr 45S, pois ele está
localizado nas regiões espaçadoras do DNAr 45S que é repetido em tandem. Neste
sentido, o número e a sua localização funcionam como marcadores cromossômicos que auxiliam no processo de identificação cromossômica (SILVA, 2014) sendo importantes na confirmação de hibridações interespecíficas.
A localização e o número de sítios observados na progênie híbrida foram correspondentes aos sítios das espécies genitoras. Os cromossomos marcadores foram
identificados nos pares 5 e 6 para P. coccinea, e nos pares 3 e 7 para P. hatschbachii, o
qual corresponde os sítios DNA Sat e DNAr 5S, respectivamente. A variação do número de sítios não observada nos híbridos HD25 sugere que os cromossomos homeólogos são semelhantes, fato que pode ter contribuído para a estabilidade dos
151
cromossomos na progênie híbrida F1. Em híbridos interespecíficos de Passiflora obtidos
do cruzamento entre P. gardneri vs. P. gibertii, a quantidade de sítios DNAr 45S
variou, onde foi observado híbridos com 5 e 6 sítios, umas vez que P. gibertii (genitor
paterno) apresentou 5 sítios e P. gardneri (genitor materno) 6 sítios. Ainda neste estudo,
os autores observaram que apenas o uso da sonda de rDNA 5S já seria capaz na confirmação da fecundação cruzada (SILVA et al., 2017 in press).
Neste trabalho foi utilizada a sonda CL69 Sat_2, a qual apresenta sítios de hibridação que colocalizam com a região DNAr 45S (PAMPONÉT, 2017), com padrão de marcação confiáveis na identificação da paternidade dos híbridos HD25,
confirmados também pela presença dos blocos CMA3+, o qual colocalizou com DNA
Sat. Assim como a sonda para DNA Sat foi eficiente, a sonda DNAr 5S também utilizada como marcador permitiu a confirmação de paternidade. Na célula, estes tipos de marcadores revelam informações que são observadas de forma clara, sendo eficiente na confirmação de cruzamentos interespecíficos. Este procedimento pode ser realizado em qualquer fase de desenvolvimento da planta, conferindo uma boa alternativa para programas de melhoramento que compreende o método de hibridações interespecíficas (SILVA, 2014).
A localização, assim como o polimorfismo de sítios ribossomais são importantes para o estudo de relações evolutivas (PAMPONÉT, 2017). Em três espéceis de
Passiflora (P. edulis, P. serratodigitata e P. alata), por exemplo, foi possível observar
marcações cromossômicas para DNA Sat possibilitando diferenças na quantidade e localização dos sítios de hibridação, sendo marcadores relevantes para caracterização de espécies (PAMPONÉT, 2017). Neste estudo não foi observado a existência de polimorfismo para os sítios de DNAr 5s e DNA Sat nas espécies genitoras e nos
genótipos híbridos. Por outro lado, em híbridos retrocruzados (RC1) de Passiflora foi
verificado polimorfismo no tamanho do sinal de hibridação para os sítios ribossomais 45S e 5S, devido a alterações/variações decorrentes dos cruzamentos entre espécies diferentes (MELO et al., 2017).
Não foi observado diferenças na quantidade e número de sítios de hibridação dos genótipos híbridos. Existem alguns fatores que podem justificar este fato. Os híbridos F1 não terem passado por recombinação meiótica, pois não tem recombinação com os cromossomos das espécies genitoras no genoma do híbrido F1, sendo possível isto em uma segunda geração de cruzamentos (F2). Alem disso, muitas das variações encontradas citogenômicamente em plantas pode ocorrer devido a irregularidades na
152
segregação cromossômica (KIIHL et al., 2011), bem como por meio de alterações cromossômicas estruturais, como translocação (MELO et al., 2017).
As sondas DNAr 5S e 45S também foram utilizadas no híbrido obtido do
cruzamento entre P. edulis Sims vs. P. cincinnata Mast. para a confirmação do caráter
híbrido, sendo identificados na progênie híbrida os sítios de cada genoma doador (COELHO et al., 2016). O uso destas sondas possibilitou a identificação de variação no
número e localização de sítios de DNAr em híbridos retrocruzados de Passiflora,
revelando recombinação meiótica nestes híbridos (MELO et al., 2017). Em outros
gêneros como, Beta L. (DESEL et al., 2002), Brassica (HASTEROK et al., 2005),
Lilium L. (MARASEK et al., 2004) e Oryza L. (XIONG et al., 2006) a aplicação da
FISH também foi utilizados na determinação do status híbrido, utilizando estes tipos de marcadores.
5 CONCLUSÕES
A aplicação das sondas de DNA genômico e ribossômico possibilita a diferenciação dos cromossomos das espécies genitoras no genoma dos híbridos interespecíficos F1, demonstrando que o uso simultâneo é ainda mais efetivo na confirmação da fecundação cruzada e que estas técnicas podem ser adotadas em
programas de melhoramento de Passiflora.
A GISH e a FISH além de permitirem a confirmação das hibridações, permite a visualização de estabilidade entre os genomas genitores nos híbridos pela ausência de translocações entre genomas e a não visualização de modificações genômicas de âmbito citológico.
6 AGRADECIMENTOS
Ao pós-doc Gonçalo Santos da Silva e ao coorientador Cláusio Antônio Ferreira de Melo da Universidade Estadual de Santa Cruz no auxílio com as análises citogenéticas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pelo apoio financeiro à pesquisa.
153
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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