CAPÍTULO I REVISÃO DA LITERATURA
2. Prática Profissional em Gerontologia Social
2.1 Como Educar/Formar os profissionais do âmbito do envelhecimento?
tridimensionnelle à haute résolution de la Ca^’^-ATPase. La combinaison des prédictions de
topologie membranaire avec les techniques classiques de modélisation par homologie a permis
d’étendre le modèle au domaine C-terminal qui présente un faible pourcentage d’identité de
séquence. Dans la première partie de ce travail, la comparaison des sites de fixation des ions
dans l’ATPase à Ca^"^ et dans le modèle de L’H”^-ATPase révèle que ce domaine n’est pas
conservé entre les deux enzymes. Ceci suggère que bien qu’il soit communément accepté que les
ATPases de type P partagent le même mécanisme de fonctionnement, chaque groupe d’ATPases
se distingue probablement par des caractéristiques structurales qui lui permettent d’assurer une
fonction de transport spécialisée.
Dans la seconde partie de ce travail, le modèle tridimensionnel de l’H^-ATPase est utilisé
pour prédire un parcours possible du proton au sein de l’enzyme. Celui-ci pourrait débuter au
niveau de l’aspartate phosphorylé dans le domaine cytoplasmique, traverser la région
membranaire et aboutir au domaine extracytoplasmique. Ce parcours est proposé d’après
l’identification des cavités polaires internes capables d’abriter des molécules d’H20. Cette
approche originale est soutenue par le fait que nous avons montré qu’elle permettait de délimiter
le parcours du proton dans la structure de la bactériorhodopsine en absence de toute autre
information. La mutagenèse dirigée a pu montrer que certains résidus sur la trajectoire proposée
pour le proton sont impliqués dans la réaction de transport, alors que le rôle d’autres résidus
reste encore inconnu. Ceci concerne en particulier les résidus polaires comme Thr^*^, Thr®^^,
Thr^'*^, Thr®*°, Ser^’^, Ser*”*’, Ser^*' ou Lys®'^ localisés à l’entrée du parcours proposé, dans le site
de phosphorylation. Etant donné le pourcentage d’identité de séquence globalement faible entre
les deux enzymes, le modèle tridimensionnel construit ici représente pour sa plus grande partie
un modèle à basse résolution de l’H^-ATPase. Dans ce modèle, la position des chaînes latérales
et donc des cavités internes est déterminée avec une précision limitée. Ceci est particulièrement
vrai pour les cavités localisées dans les derniers segments transmembranaires du domaine C-
terminal. C’est pourquoi le rôle des résidus en contact avec les cavités du domaine
transmembranaire a été discuté sur base des résultats de mutagenèse dirigée. D’un autre côté, le
Résultats et discussions
domaine de phosphorylation où nous proposons que le point d’entrée du dans l’enzyme est
localisé constitue un partie beaucoup plus fiable du modèle. En effet, les séquences des ATPases
eucaryotiques sont essentiellement conservées dans ce domaine. Nous avons également montrés
que le fold de ce domaine est remarquablement conservé entre la Ca^’^-ATPase et les membres
solubles des haloacides déhalogenases dont l’activité catalytique procède essentiellement par le
même mécanisme. De plus, les résidus catalytiques occupent les mêmes positions dans les
structures tridimensionnelles des deux enzymes. Les prédictions de structures secondaires
réalisées pour plusieurs P-ATPases incluant l’IL^-ATPase sont également remarquablement bien
conservées dans ce domaine. Enfin, la structure secondaire du domaine de phosphorylation
observée sur le modèle construit sur base des coordonnées de la Ca^^-ATPase et celle
déterminée directement à partir de la séquence en acides aminés de l’H^-ATPase, sont également
en excellent accord. Tout ceci nous indique que la structure tertiaire du « Rossman fold » est
très probablement conservée chez les P-ATPases. Ceci permet d’estimer qu’il constitue la partie
la plus précise du modèle tridimensionnel et supporte donc la conclusion sur le point d’entrée du
proton dans l’enzyme que nous avons principalement localisé dans ce domaine. Une observation
supportant un rôle fonctionnel pour les cavités internes du domaine de phosphorylation provient
de l’analyse du domaine homologue des membres solubles de la superfamille des HAD. En
effet, dans ces enzymes, qui à la différence de l’H^-ATPase ne réalisent pas de fonction de
transport, un parcours similaire ne peut pas être tracé.
4.2 E
tude du mécanisme de transport ionique au travers du domaine
MEMBRANAIRE DE L’H^-ATPASE DE NEUROSPORA CRASSA.
L’idée à la base du mécanisme de transport réalisé par les P-ATPases est celle de
l’alternance de l’accessibilité des sites de fixation. L’explication du mécanisme de transport
repose à l’origine sur les changements conformationnels subis par l’enzyme, et a par la suite été
modifiée pour inclure l’idée d’un mécanisme de transport présentant des propriétés semblables à
celles d’un canal ionique. Dans ce cas, les modifications conformationnelles sont toujours
impliquées mais sont couplées à des étapes du cycle qui permettent de moduler la hauteur des
barrières énergétiques vues par les ions au travers d’un canal accessible du côté
extracytoplasmique [81].
Plusieurs questions restent encore en suspens. Est-ce le site de fixation lui-même qui
traverse une barrière de perméabilité suite à un changement conformationnel ? Dans la Na'^/K'^-
ATPase, l’insertion du fragment trypsique correspondant à M5 et M6 participant au site de
fixation ionique, est altérée lorsque l’enzyme est clivée en absence de K^. Bien que cette
observation ne concerne qu’indirectement l’étape de transport, elle est en accord avec
l’hypothèse que certains segments possèdent des degrés de libertés qui autoriseraient le
mouvement du site de fixation dans le domaine membranaire [79, 80].
Alternativement, dans une conformation particulière de l’enzyme, l’ion transporté pourrait
« sauter » d’un site à un autre sous le contrôle d’une barrière énergétique. Les mesures directes
de l’étape du transport ionique chez la Na^, K^-ATPase supportent la seconde hypothèse. En
effet, il a été montré que depuis un état occlus, les ions peuvent diffuser à grande vitesse dans le
domaine membranaire jusqu’au milieu extracellulaire en traversant 70% du champ électrique
membranaire (voir § 1.4.1.1, « Introduction »). Dans ce cas, la constante de vitesse associée au
mouvement du dernier ion Na^ est tout à fait comparable aux constantes de vitesse associées au
transport dans les canaux ioniques (> 10® ions.sec''). Cependant, bien que ces mesures indiquent
que les ions migrent très rapidement depuis des positions énergétiquement distinctes dans le
champs électrique, elles n’impliquent pas que ces positions soient nécessairement séparées par
une longue distance dans l’enzyme.
Dans cette partie, nous avons tenté de répondre à cette question en mesurant le transport
ionique au travers du domaine membranaire de l’H^-ATPase. Nous avons effectué des mesures
électrophysiologiques permettant de déterminer si ce domaine membranaire, isolé par clivage
protéolytique, contenait une structure capable transporter les ions à grande vitesse de part et
d’autre de la membrane. Ces mesures apportent des informations importantes concernant la
réaction de transport réalisée par l’H^-ATPase. Elles seront également discutées par référence à
Fig. 4.6.- SDS_PAGE sur un gel
Tris-tricine (16.5%, 6%) coloré à
l’argent permettant de suivre la
cinétique de digestion à la
clostripaïne rH*-ATPase.
(A) . Concanavaline A (utilisée dans
le protocole de purification de l’H'"-
ATPase)
(B) . Clostripaïne
(C) . H*-ATPase reconstituée
Mw
(kDa)
43
29
18.4
14.3
6.2
2.3
28kDa
15kDa
9kDa
SDS_PAGE sur un
