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4.2 Análises e desreplicação de compostos fenólicos das folhas de Passiflora ssp.

4.2.4 Desreplicação dos compostos fenólicos das folhas de Passiflora ssp

4.2.4.1 Desreplicação dos flavonoides C-glicosilados

Flavonoides C-glicosilados são os constituintes químicos mais citados para as espécies de Passiflora, apresentando uma ampla distribuição no gênero (DHAWAN; DHAWAN; SHARMA, 2004). Substâncias dessa classe são bastante utilizadas como marcadores químicos, principalmente pela sua grande ocorrência, estabilidade química, diversidade estrutural e disponibilidade de métodos de análises (GOSMANN et al., 2011).

A partir da análise da RM pôde ser observada a formação de dois clusters predominantemente contendo esses metabólitos: um sugerindo ser formado apenas por flavonoides C-glicosilados e outro contendo também O-glicolisação na hidroxila fenólica e/ou no açúcar ligado à porção aglicona (figura 15).

Após análise dos espectros de EM/EM relativos aos nós que compõem os clusters dessa subclasse, pôde-se verificar uma tendência dessas substâncias em se agruparem por número de unidades de açúcar presentes em suas estruturas, sendo que os flavonoides com três unidades de açúcares são aqueles que mais se destacaram, como pode ser observado na figura 16.

Figura 16 – Mapa de rede molecular, associado aos dados de EM/EM obtidos no modo positivo de ionização para Passiflora ssp, representando os flavonoides C- glicosilados que possuem proposta de identificação – Parte I

Fonte: Autoria própria

Seguindo a análise, percebeu-se também que o tipo de ligação glicosídica contribuiu fortemente para formação dos clusters, sendo observadas aglomerações bem definidas para cada uma delas, conforme figura 17. O tipo de aglicona também auxiliou, porém em menor proporção quando comparado com o tipo de ligação e número de unidades glicosídicas. O valor de cosseno entre os análogos identificados foi superior a 0,85, reforçando a grande similaridade entre eles e contribuindo para uma correta identificação. Essas tendências também foram observadas nas análises realizadas para P. cincinnata e aqui foram fundamentais para qualidade da RM gerada e para a identificação das substâncias que a compõem.

Figura 17 – Mapa de rede molecular, associado aos dados de EM/EM obtidos no modo positivo de ionização para Passiflora ssp, representando os flavonoides C- glicosilados que possuem proposta de identificação – Parte II

Fonte: Autoria própria

Dentre os flavonoides C-glicosilados identificados, a substância 92 (tabela 3 do apêndice), chamou-nos a atenção pelo seu perfil de fragmentação, sugerindo a presença de três unidades glicosídicas, sendo todas ligadas à aglicona por C-glicolisação. Ela apresentou como íon precursor [M + H]+ m/z 727, e, no espectro de EM/EM, foi observado como pico

base o íon precursor [M + H - 18]+ m/z 709 seguido do íon [M + H - 66]+ m/z 661, [M + H -

36]+ m/z 691, [M + H - 108]+ m/z 619, sendo este último possivelmente relativo à perda

neutra de 90 u de uma das unidades glicosídicas e a eliminação de H2O de outra unidade. A

eliminação de uma unidade glicosídica é normalmente observada em flavonoides que possuem uma O-glicolisação em ambos os modos de ionização como pico base (VUKICS;

GUTTMAN, 2010); devido à ausência de um íon com essas características, os dados obtidos nos levaram a sugerir que esta substância pode apresentar três ligações C-glicosídicas. Entretanto, não há relato, na literatura, de substâncias dessa classe com essas características.

A literatura relata a possibilidade de extensiva fragmentação da porção glicídica para flavonoides O-glicosilados analisados no modo positivo de ionização (MARCH et al., 2006). Como parte complementar deste trabalho, nós estudamos o perfil de fragmentação de um novo derivado fenólico isolado de Eremanthus glomerulatus (AMARAL et al., 2017) no modo negativo de ionização, e também observamos extensiva fragmentação da glicose presente nessa substância com perdas neutras de 60, 90 e 120 u, como pode ser observado na figura 18.

Figura 18 – Proposta de fragmentação de um novo derivado fenólico com extensiva fragmentação da glicose

Fonte: Amaral et al. 2017

Então, visando o encontro de novas informações que possam definir uma melhor proposta de identificação, o espectro de ionização no modo negativo para essa substância foi consultado na plataforma GNPS e analisado.

O espectro de EM/EM de 92, no modo negativo, apresentou como íon precursor o íon [M - H]- m/z 725 e o íon produto [M - H - 162]- m/z 563 (Y-) como pico base, indicando, desta

hemiacetal glicosídica pela transferência de um próton do açúcar para o átomo de oxigênio glicosídico (DEMARQUE et al., 2016). Essa fragmentação caracteriza que um dos açúcares é do tipo hexose e está ligado à aglicona por uma ligação O-glicosídica em uma das hidroxilas fenólicas da aglicona (FERRERES et al., 2007; VUKICS; GUTTMAN, 2010), e não em uma ligação do tipo C-glicosidica, como sugere a fragmentação no modo positivo, verificando, assim, que esta substância apresenta padrão de fragmentação no modo positivo não trivial, mas semelhante a alguns outros compostos fenólicos relatados na literatura (MARCH et al., 2006) e também avaliados pelo nosso grupo (AMARAL et al., 2017).

Também observamos a formação do íon [M - H - 162 - 210]- m/z 353 (0,2X 6;8;),

indicando que as outras duas unidades de açúcar estão ligadas por C-glicolisação e são do tipo hexose e pentose e que, devido à formação do íon [M - H - 120]- m/z 605 (0,2X

6) com 49% de

intensidade relativa, a hexose está ligada no carbono 6 (FERRERES et al., 2003; FERRERES et al., 2007).

Com essa análise, pôde-se identificar esta substância como sendo apigenina-6-C- hexose-C-8-pentose-O-Hexose, substância ainda não identificada no gênero e aqui encontrada para as espécies P.foetida e P.edulis, de acordo com a tabela 3 do apêndice.

A organização dos dados por RM, juntamente com as anotações realizadas pela biblioteca do GNPS e com os dados da literatura, levou-nos a propor a identificação de 109 substâncias detectadas que possuem ao menos uma ligação C-glicosidica. Os derivados de flavona (apigenina, luteolina e crisina) foram as principais substâncias presentes, sendo os di- substituídos a maioria e a hexose o principal substituinte. Foram observadas também substâncias com três unidades de açúcar do tipo deoxihexose, dideoxihexose e pentose. A proposta de identificação de cada uma dessas substâncias pode ser observada na tabela 3 do apêndice. As estruturas moleculares para os principais flavonoides C-glicosilados com proposta de identificação estão na figura 19.

Figura 19 – Estruturas moleculares dos principais flavonoides C-glicosilados com proposta de identificação detectados em Passiflora ssp.

185 187

207 93

96 92

105 97

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