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IV) Linha celular – TZM-bl, infecção

4. Discussão dos resultados e Conclusões

Com este trabalho pretendeu-se modificar a proteína A3G para que esta fosse capaz de manter uma localização nuclear no contexto celular, de forma a evitar a acção da proteína viral Vif que decorre no citoplasma e que culmina na degradação proteossomal da desaminase celular. Neste sentido, foram desenvolvidas construções que visavam a produção de uma proteína A3G, contendo uma sequência-sinal NLS, capaz de ser expressa numa linha celular humana caracterizada por um fenótipo permissivo – células HEK 293T.

Contudo, os resultados obtidos não corresponderam totalmente ao esperado: esta proteína expressa é sujeita a modificações pós-traducionais que modificam a sua sensibilidade à Vif e a sua capacidade de inibir a infecção nas próximas células-alvo, para além de impedirem a sub-localização nuclear desejada. De facto, os resultados apontam para a ocorrência de uma clivagem a nível da extremidade N-terminal da proteína, que para além de remover a sequência NLS também elimina alguns aminoácidos dessa extremidade (Figuras 9, 10 e 11). Esta clivagem parece ocorrer à priori do transporte para o núcleo, uma vez que num contexto in vitro esta restrição é conservada (Figura 11), podendo-se extrapolar que esta degradação parcial é efectuada por um (ou mais) factor(es) citoplasmático(s). É possível ainda afirmar que esta clivagem terá de ocorrer por um (ou mais) mecanismo(s) que permite(m) o reconhecimento de duas localizações distintas da sequência da A3G, uma mais externa e outra mais interna, de forma a originar as duas versões truncadas detectadas (com 41kDa e com 36kDa, respectivamente).

Esta hipótese de exclusão do núcleo já tinha sido mostrada por outros autores (Bennett et al., 2006 e Bennett et al., 2008), que no entanto não verificaram qualquer clivagem ou degradação da proteína, embora os estudos efectuados não visassem a análise do tamanho das proteínas construídas mas sim a identificação da sub-localização celular por métodos de fluorescência. Segundo esta publicação, este facto deve-se à presença de uma sequência com forte poder de retenção citoplasmática (localizada entre os aminoácidos 113 e 128), que mesmo na presença de uma sequência localizadora do núcleo, tem a capacidade de sobrepor o seu efeito e anular o sinal NLS.

Não obstante, uma outra forma de justificar a manutenção da localização citoplasmática pode corroborar a hipótese de trabalho proposta. Esta supõe que a proteína A3G modificada é capaz de se translocar para a proximidade da membrana celular de forma a ser encapsidada nos novos viriões, conseguindo evitar a ligação à Vif por ligação à poliproteína Gag ou por desfasamento temporal dos níveis citoplasmáticos das duas proteínas. No entanto, outros estudos seriam necessários para que esta hipótese fosse consolidada e aceite como forte representante do que acontece ao nível da célula.

D is c u s s ã o d o s r e s u lt a d o s e C o n c lu s õ e s

Através da análise da interacção Vif-A3G, foi possível detectar que a versão truncada da proteína A3G com aproximadamente 41kDa é mais sensível à degradação induzida pela Vif do que a proteína com cerca de 36kDa, e mesmo até do que a proteína A3G selvagem (Figura 12). A grande diferença na sensibilidade à acção da proteína viral registada entre os quatro clones testados pode ser indicadora de uma certa promiscuidade no reconhecimento dos aminoácidos que representam o local de corte. Deste modo, diferenças num número reduzido de aminoácidos não provoca uma alteração visível no tamanho da proteína mas pode ser suficiente para se manifestar em diferenças significativas no fenótipo de sensibilidade à Vif. Assim sendo, é possível concluir que o local de corte poderá localizar-se dentro da região identificada como vital para a ligação à extremidade N-terminal da Vif (aminoácidos 54 a 124 e 128), dificultando o reconhecimento por parte da Vif destas proteínas truncadas; ou na porção N-terminal adjacente a este local, que embora resulte numa proteína de menores dimensões que a proteína selvagem é igualmente ou até mais eficientemente marcada para a degradação. No que diz respeito à proteína com 36kDa, a diminuição da sensibilidade à acção da Vif demonstra que esta clivagem ocorre garantidamente dentro da região de ligação à Vif (ou seja, entre os aminoácidos 54 e 128).

A determinação da capacidade de inibição da infecção viral destas proteínas modificadas pareceu revelar-se denunciadora de uma localização mais restrita dos locais onde ocorre a clivagem. Visto que todas as proteínas expressas pelos clones testados foram capazes de abolir totalmente a infecção (algo que não se verificou com a proteína A3G selvagem) (Figura 14), é possível concluir que os cortes que resultam nas proteínas truncadas ocorrem dentro da região de interacção com a proteína Vif mas antes do domínio CD1; ou seja, entre os aminoácidos 54 e 64, uma vez que a encapsidação da desaminase (Figura 13) e a sua função não são afectadas, pelo contrário, são potenciadas. Controversamente, a presença de Vif nas células produtoras torna as partículas virais produzidas na presença das proteínas construídas mais infecciosas do que as produzidas na presença da A3G selvagem, o que não corrobora as deduções retiradas até agora. Se por um lado a clivagem origina proteínas com um poder anti-viral mais potente, por outro lado este efeito é mais fortemente inibido pela proteína do vírus.

Por estas razões aqui sumariadas, demonstra-se que permanece a necessidade de efectuar mais estudos que permitam desvendar os mecanismos de interacção destas duas proteínas, de forma a se atingir uma compreensão mais profunda dos efeitos provocados pelo HIV-1 nas células do Homem, possibilitando a descoberta de novas terapias anti-virais.

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