Docking proteína-proteína

As coordenadas para os modelos dos fragmentos N-terminal e C-terminal livres foram obtidas da estrutura de RMN do complexo cabeça-cauda (PDB: 2G9J – Modelo 1). O peptídeo do C-terminal (Tm268-284(W269)) foi construído a partir das

coordenadas dos resíduos 268 a 284 da estrutura de RMN com duas modificações: A269W e K279N. O peptídeo do N-terminal (ASTm1-15) foi construído a partir das

coordenadas dos resíduos 1 a 15. Uma fusão Ala-Ser foi adicionada no N-terminal – resíduos A(-1) e S(0). Deste modo, as seqüências dos peptídeos são similares aos usados nos experimentos de afinidade, a única diferença foi a presença de triptofano ao invés de 5-hidroxitriptofano na posição 269 do C-terminal. As duas estruturas iniciais (tipo-selvagem), assim como a estrutura dos outros mutantes (D2A, K7A, D275A, H276A, H276E, D2A-D275A, D2A-H276A, D2A-H276E, K6A-H276A, K6A- H276E, K7A-H276A, K7A-H276E) foram construídas por modelagem por homologia usando MODELLER (Sali e Blundell, 1993) do pacote de softwares InsightII

(Accelrys Inc.).

Os cálculos para o docking proteína-proteína foram feitos com HADDOCK 1.3

usando CNS 1.1 (Brunger et al., 1998; Dominguez et al., 2003) com o campo de

força parallhdg 5.3 e os parâmetros não ligados (non-bonded) OPLSX (Linge et al.,

2003). O docking foi dirigido por restrições de interações ambíguas (Ambiguous Interaction Restraints – AIR). AIRs são restrições derivadas de todo o tipo de

informação experimental (Fig. 18) (mutagênese sítio dirigida, ligação cruzada, perturbações no deslocamento químico (RMN), etc) que podem indicar quais são os resíduos localizados na interface de interação em um complexo protéico (Dominguez

Os resíduos na interface de interação são classificados em dois tipos: ativos e passivos. Em nosso caso resíduo ativos são aqueles que os nossos dados de mutagênese indicaram como sendo relevantes para a formação do complexo cabeça-cauda, enquanto os resíduos passivos foram os resíduos vizinhos aos ativos (Fig. 19). Na interface do C-terminal, D280 foi ativo enquanto os resíduos vizinhos A277, M281, S283 e I284 foram considerados passivos, na interface do N-terminal K5 foi ativo, enquanto os resíduos vizinhos I4 e K7 foram considerados passivos. Um AIR mais específico foi introduzido entre L278 e A3, uma vez que a interação entre estes dois resíduos foi observada na estrutura de RMN (Greenfield et al.,

2006), e a mutação de um ou outro resíduo para Cys rompeu a formação do complexo cabeça-cauda. Esta restrição adicional permitiu um melhor ajuste do N- terminal na cavidade do C-terminal no docking dos fragmentos do tipo-selvagem.

Para o docking dos fragmentos mutados nós assumimos que todos os AIRs que não

envolvem os resíduos mutados deveriam ser preservados.

que podem ser empregadas para definir resíduos na interface de interação (AIRs). Na esquerda são mostradas as vantagens (+) e desvantagens (-) de cada metodologia. Os componentes que integram o complexo estão à direita. Mutagênese: estrela representa um resíduo mutado. Ligação-cruzada: linha preta representa uma ligação cruzada. Troca próton-deutério: D e H representam resíduos onde a troca pode (D) ou não ocorrer (H). Perturbação do deslocamento químico: espectro de HSQC demonstrando que a formação do complexo tem um efeito no deslocamento químico do resíduo B, enquanto A não é afetado. RDC, relaxação: orientações dos vetores de difusão podem ser empregadas na modelagem do complexo – orientação das moléculas (van Dijk et al., 2005).

L278 L278 D280 A277 A277 M281 S283 I284 S283 I284 I4 K7 A3 K5 M281 A3

Os segmentos compreendendo os resíduos -1 a 14 do N-terminal e 273 a 284 do C-terminal foram considerados como interface. Nesta região as cadeias laterais e a cadeia principal possuem mobilidade durante o docking, enquanto o restante da

molécula é mantido rígido. Adicionalmente, nós utilizamos restrições para manter os ângulos diedrais com valores encontrados em estruturas helicoidais (psi=40º±10, phi=60º±10), além de restrições para manter as pontes de hidrogênio intramoleculares. Restrições hélice-hélice (Nilges e Brünger, 1991) para manter as cadeias paralelas no caso do C-terminal, e manter o motivo em coiled-coil do N-

terminal também foram usadas. No caso do C-terminal as restrições hélice-hélice foram definidas de modo que a distância intercadeia entre os átomos Cα dos resíduos 268, 269 e 270 foi mantida similar àquela observada na estrutura de RMN (Greenfield et al., 2006). Estes resíduos se encontram fora da região de

sobreposição, dando liberdade para a separação das hélices na interface. Restrições similares foram empregadas para os resíduos 8, 9 e 10 do N-terminal. Restrição para manter simetria C2 (Nilges, 1993) foi usada para manter a simetria do complexo observada no modelo de RMN (Greenfield et al., 2006).

O protocolo de docking consistiu de uma minimização de energia inicial em que

as estruturas foram tratadas como corpos rígidos – movimentos de rotação e translação foram permitidos e 1000 modelos foram calculados. As estruturas foram

Figura 19. Resíduos empregados como AIR para dirigir o docking. Esta figura demonstra os resíduos ativos (vermelho) e passivos (azul claro) na interface do C- (azul) e N- (rosa) terminais usados como restrições ambíguas para a modelagem do complexo cabeça-cauda por docking usando o programa HADDOCK (Dominguez et al., 2003). A figura foi desenhada em Pymol.

então ordenadas de acordo com o HADDOCK score (0,1xEvdw + Eelec + EAIR + Esym –

0,01xEBSA), os 200 melhores modelos foram submetidos a uma etapa de simulated annealing semi-flexível em espaço torsional seguidos então por uma etapa de

refinamento em solvente explícito (água) (Fig. 20). As estruturas finais foram então ordenadas de acordo com um novo HADDOCK score (Evdw + 0,2xEelec + EAIR +

0,1xEsym) e agrupados em clusters usando um corte de 1,5 Å. Clusters com

estruturas com menor valor de RMSD em relação ao modelo de RMN (Greenfield et al., 2006) tiveram seus contatos intermoleculares (pontes de hidrogênio, interações

de van der Waals) analisados usando LIGPLOT (Wallace et al., 1995). O RMSD da

cadeia esquelética foi calculado usando os átomos N, Cα e C’ dos resíduos 1-14 do N-terminal, e os resíduos 268-280 do C-terminal, usando o programa PROFIT (A. C. R. Martin, www.bioinf.org.uk/software/profit).

Figura 20. Etapas durante o processo de docking em

HADDOCK. As etapas que ocorrem durante o docking estão ilustradas nos painéis. O número de estruturas gerada em cada etapa está indicado. Inicialmente as proteínas são posicionadas a uma distância de 150 Å e rotacionados ao redor de seu centro de massa. Posteriormente, é feito um docking rígido das estruturas N (rosa) e C (azul) terminal, 1000 estruturas são geradas nesta etapa. 200 modelos de menor energia são selecionados automaticamente pelo programa para serem refinados empregando simulated annealing. Em uma etapa posterior é feito o refinamento das estruturas na presença de água para optimização das interações na interface entre as proteínas (Dominguez et al., 2003).

2º–Etapa de minimização (Docking como um corpo rígido) 1º–Etapa de randomização

Proteínas são posicionadas a uma

distância de 150 Å e rotacionadas ao redor de seu centro de massa.

3º –Refinamento por Simulated Annealing

3 etapas:

• Proteínas são tratadas como corpos rígidos – orientação é optimizada;

• Cadeias laterais na interface adquirem mobilidade;

• Cadeias laterais e esqueleto polipeptídico adquirem mobilidade. 4 – Refinamento em água (1000 estruturas) (200 estruturas) (200 estruturas) 150 Ǻ • Refinamento em água;

• Optimização da energia na região da interface entre as proteínas.

Energia Baixa

Energia Alta Energia Intermediária N-terminal C-terminal N-terminal C-terminal C-terminal N-terminal 2º–Etapa de minimização (Docking como um corpo rígido) 1º–Etapa de randomização

Proteínas são posicionadas a uma

distância de 150 Å e rotacionadas ao redor de seu centro de massa.

3º –Refinamento por Simulated Annealing

3 etapas:

• Proteínas são tratadas como corpos rígidos – orientação é optimizada;

• Cadeias laterais na interface adquirem mobilidade;

• Cadeias laterais e esqueleto polipeptídico adquirem mobilidade. 4 – Refinamento em água (1000 estruturas) (200 estruturas) (200 estruturas) 150 Ǻ 150 Ǻ • Refinamento em água;

• Optimização da energia na região da interface entre as proteínas.

Energia Baixa

Energia Alta Energia Intermediária N-terminal

C-terminal

N-terminal

C-terminal