Eletroforese em gel com gradiente desnaturante

Nesse estudo a fim de entender o comportamento dos microrganismos presentes ao longo das fases empregadas, foram realizadas coletas da biomassa aderida às partículas ao final de cada fase operacional. As mudanças nas populações de bactérias podem ser verificadas através da análise do perfil de bandas por eletroforese

em gel gradiente desnaturante (DGGE) para bactérias (Figuras 5.15 e 5.16) e arqueias (Figuras 5.17 e 5.18). Durante as fases foi verificado alteração significativa entre as populações, provavelmente, houve seleção de bactérias em função dos parâmetros impostos.

Figura 5. 16 Coeficiente de similaridade através da correlação de Pearson a partir do perfil de bandas do DGGE em relação às fases operacionais aplicadas ao reator R5 (5 gDQO.L-1_{) para o domínio Bacteria.}

Observou-se menor coeficiente de similaridade de 55% para a biomassa da fase I (0%, 6h) em relação as demais fases de operação para as populações de bactérias. Nessa fase, apenas glicose estava sendo empregada como fonte orgânica para o tempo de detenção hidráulica de 6 h. Em comparação, verificou-se que entre a fase II (25%, 6h) e a fase III (75%, 6h) esse coeficiente de similaridade aumentou para 83 %, provavelmente, devido a presença de novo substrato, a vinhaça (25%), favorecendo a seleção de microrganismos mais adaptados aquela condição. Em relação a fase IV (100 %, 6h) verificou-se diminuição da similaridade entre as populações em comparação com a fase III, quando a similaridade observada foi entre 76%. Diante da presença única de vinhaça como substrato orgânico, possivelmente, novos microrganismos foram favorecidos, como foi observado diante do maior número de bandas na fase IV.

De acordo com o índice de diversidade de Shannon-Wiener verificou-se que a amostra mais diversa em ordem decrescente foi R5 V (4,90)>R5 IV(4,38)>R5 II(4,16)>R5VI (3,49) > R5III (3,24) >R5 VII (3,23) >R5 I (2,88). Entre as fases IV e V (100%,4h) foi feita a redução do TDH de 6 para 4 h e verificou-se aumento de 82% de correlação. Com nova redução de TDH para 2 h na fase VI verificou-se que o coeficiente permaneceu inalterado. De fato, verificou-se comportamento bastante similar do reator R5 durante as fases V e VI no que se refere a produção de biogás, ácidos orgânicos e consumo de carboidratos. Na última fase VII (100% de vinhaça) para

TDH de 1 h, verificou-se coeficiente de similaridade de 82 % em comparação com a fase VI (100%, 2 h). É provável que populações que foram desfavorecidas nas fases seguintes se adaptaram de modo a retornarem a condições prévias à redução do TDH. As populações mais adaptadas permaneceram no reator, enquanto outras podem ter sido lavadas do reator devido às maiores condições hidrodinâmicas de baixo TDH.

Figura 5. 17 Coeficiente de similaridade através da correlação de Pearson a partir do perfil de bandas do DGGE em relação às fases operacionais aplicadas ao reator R10 (10 gDQO.L-1) para o domínio Bacteria.

O reator R10 apresentou um comportamento semelhante ao reator R5 no que se refere ao perfil apresentado diante da variação das fases operacionais. O menor coeficiente de similaridade foi obtido na fase R10 I em que foi obtido um valor de 67 % em relação as fases seguintes. A introdução de vinhaça no sistema levou a um aumento da similaridade que atingiu 87 % entre as fases II e III as quais foram as mais semelhantes dentre as amostradas. Entre a fase IV e V o coeficiente de similaridade apresentou uma redução atingindo 84%. Entre as fases VI e VII o coeficiente de similaridade ficou em 77 %. Verifica-se que o aumento da concentração de vinhaça nas fases II, III e IV bem como a redução do TDH de 6 a 1 h nas fases V, VI e VII levou a uma diminuição nas similaridades apresentadas. Isso é um indicativo que pode ter havido variação da população bacteriana seja ocasionado por lavagem em baixo valor de TDH ou por adaptação a presença de um substrato mais complexo.

Devido a formação de metano a partir da fase IV (100%, 6h) em ambos os reatores também foi feita a eletroforese em gel gradiente desnaturante para as arqueias metanogênicas (Figuras 5.18 e 5.19).

Figura 5. 18 Coeficientes de similaridade através da correlação de Pearson a partir do perfil de bandas do DGGE em relação às fases operacionais aplicadas no reator R5 (5 gDQO.L-1_{) para o domínio Archaea}

Na Figura 5.18 está ilustrado o perfil de bandas para o reator R5 (5 gDQO.L-1_{) em relação ao Domínio Archaea. Verificou-se no início da operação do}

reator similaridade de 70% entre essa fase e as demais fases (II, III, IV, V, VI e VII). Verificou-se que em função das mudanças de fases operacionais no reator ocorreu aumento da similaridade entre as populações para as diferentes fases. Provavelmente, houve uma seleção de arqueias em função das condições operacionais impostas. As maiores similaridades ficaram acima de 90% e foram observadas nas últimas fases (VI e VII) coincidindo com a maior produção de metano no reator.

O perfil de bandas para o reator R10 está ilustrado na Figura 5.19. Verificou-se para a fase II uma similaridade de 55 %, ou seja, menor em relação as fases operacionais seguintes. Durante essa etapa foi feita a adição de vinhaça ao sistema. Possivelmente, houve um choque nas populações presentes, de modo que apenas as mais adaptadas se mantiveram sob essa condição. Quando se fez o aumento da proporção de vinhaça nas etapas seguintes, essas populações se mostraram mais adaptadas à presença de um substrato mais complexo. A partir da fase IV verificou-se similaridade entre 77 e 97% entre as fases I, VI, VII e V. Provavelmente, ocorreu adaptação das populações à presença de um substrato complexo como a vinhaça neste reator.

Figura 5. 19 Coeficientes de similaridade através da correlação de Pearson a partir do perfil de bandas do DGGE em relação às fases operacionais aplicadas no reator R10 (10 gDQO.L-1_{) para o domínio Archaea. OBS: R10 III – essa amostra não foi possível}

amplificar, provavelmente, as populações de arqueia presentes estavam abaixo do limite de detecção da técnica.