Resumo
A testosterona é um hormônio esteróide fundamental para manutenção e recuperação da espermatogênese após danos testiculares. As células de Leydig produzem testosterona em resposta ao estímulo do LH, desencadeando processos de sinalização celular envolvendo entrada de Ca2+ e saída de K+ através de canais na membrana plasmática. Entretanto, os mecanismos de sinalização nas células de Leydig envolvendo os canais iônicos durante o estresse celular ainda precisam ser esclarecidos. Devido a importância dos canais de Ca2+ e K+ na esteroidogênese e sua possível relação com a sinalização durante o estresse celular; o presente trabalho objetivou analisar os efeitos do estresse térmico (43ºC / 15 min.) e da inibição da Hsp90 nos canais de cálcio CaV3 tipo-T e potássio ativados por cálcio (BKCa) em
células de Leydig frescas. Os resultados obtidos revelaram que nos canais BKCa o estresse
térmico reduziu a corrente do estado estacionário em 49,8%, a condutância máxima em 68,9% e a constante de tempo da ativação em 31,9%. O estresse térmico tornou mais lenta a ativação dos canais BKCa e reduziu sua dependência de voltagem. A inibição da Hsp90 não alterou a
corrente dos canais BKCa. A corrente dos canais CaV3 tipo-T não foi afetada pela temperatura
elevada ou pela inibição da Hsp90. As análises de microscopia confocal demonstraram que a administração do inibidor da Hsp90 não alterou o transiente do cálcio intracelular. Em conclusão, o choque térmico pode inibir os canais BKCa, o que pode ser um dos mecanismos
de sinalização relacionados ao estresse celular nas células de Leydig. A Hsp90 parece não estar envolvida neste processo.
Palavras-chave: Canais de cálcio e canais de potássio, choque térmico, Hsp90, 17-DMAP- Geldanamicina, células de Leydig, cálcio intracelular.
Introdução
Aproximadamente 8% dos homens apresentam problemas de infertilidade, destes 10% possuem causas reversíveis afetando seu potencial fértil (Esteves et al., 2011). O calor é um dos agentes que pode desencadear reversivelmente a degeneração testicular, caracterizada pela deterioração da estrutura do testículo com perda da sua função normal (Turner, 2007). Todos os tecidos são susceptíveis a danos pelo calor. Contudo, os testículos são especialmente sensíveis e são danificados pela exposição a temperaturas normalmente encontradas dentro do abdômen, pois o seu funcionamento normal ocorre 2 a 6 °C abaixo da temperatura corporal (Jensen et al., 2006; Sakallioglu et al., 2007). Apesar das células germinativas apresentarem grande sensibilidade a danos causados pela temperatura elevada, as células de Leydig são mais resistentes ao calor e sua capacidade esteroidogênica parece não ser diretamente afetada pelo estresse térmico (Setchell, 2006).
A espermatogênese é regulada por uma complexa e interligada rede de interações endócrina, parácrina e autócrina (Roser, 2008). Dentre os principais fatores reguladores da espermatogênese está a testosterona, que em indivíduos adultos é fundamental para a regulação do comportamento sexual, manutenção funcional da espermatogênese, epidídimo e das glândulas sexuais acessórias (Holdcraft e Braun, 2004; Verhoeven et al., 2007). As células de Leydig produzem testosterona em resposta ao acoplamento do hormônio luteinizante (LH) ao receptor 7-transmembrana proteina-G, resultando no aumento do cAMP (Svechnikov et al., 2010) e do Ca2+ intracelular (Costa e Varanda, 2007). O aumento do Ca2+ intracelular ocorre devido à entrada dos íons através de canais CaV3 tipo-T localizados na membrana plasmática
(Costa et al., 2010). Em resposta a entrada de Ca2+ na célula de Leydig, ocorre um feedback negativo através da repolarização da membrana devido ao efluxo de K+ através de canais BKCa (Carnio e Varanda, 1995).
A exposição a agentes tóxicos pode alterar a homeostase celular, o que é comumente denominado estresse celular. Diversos fatores estão envolvidos na resposta das células durante e após a exposição a condições adversas que levem ao estado de estresse (Herr e Debatin, 2001). Apesar da importância fisiopatológica deste processo, os mecanismos de sinalização nas células de Leydig relacionados ao estresse celular ainda precisam ser esclarecidos.
As respostas celulares devido ao estresse térmico podem alterar as correntes iônicas (Wu et al., 2001; Chen et al., 2010). Diversos fatores estão associados ao estresse celular, inclusive as proteínas de choque térmico de 90 kDa (Hsp90). A Hsp90 é uma chaperona molecular associada com funções na célula normal (Zuehlke e Johnson, 2010) e após o estresse celular (Murphy et al., 2001). Estudos vêm demonstrando que as Hsp’s interagem com canais iônicos de diversos tipos celulares, tais como os canais de K+ATP das células β
pancreáticas (Yan et al., 2010), canais de cloreto (ClC-2) (Hinzpeter et al., 2006) e canais de potássio hERG (Walker et al., 2010) em células HEK-293.
Visando esclarecer se os canais iônicos estão envolvidos na resposta das células de Leydig ao estresse celular e se a Hsp90 pode modular este processo; o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do choque térmico e da inibição da Hsp90 na atividade dos canais de cálcio CaV3 tipo-T e nos canais de potássio BKCa em células de Leydig frescas.
Materiais e Métodos
As células de Leydig frescas foram obtidas de camundongos machos (Mus musculus) com 45 a 60 dias de vida de acordo com a metodologia descrita por Costa e Varanda (2007). Após a eutanásia através de deslocamento cervical, os testículos dos animais foram removidos, a túnica albugínea retirada e o parênquima testicular foi mecanicamente dissociado através da infusão de solução de Hanks no espaço intersticial (mM: 140 NaCl, 4.6 KCl, 1.6 CaCl2, 1.13 MgCl2, 10 D-glicose, 5 NaHCO3, 10 HEPES; pH ajustado para 7.4 com
KOH e osmolaridade de 290-310 mosmol (kg H2O)-1). As células foram coletadas para a formação dos seguintes grupos experimentais:
• Células de Leydig não expostas ao choque térmico (Controle 1).
• Células de Leydig não expostas ao choque térmico pré-tratadas com o inibidor da Hsp90 durante 2 horas.
• Células de Leydig não expostas ao choque térmico nas quais foram obtidos registros controles e depois tratadas com o inibidor da Hsp90. Estas células são controles delas mesmas.
• Células de Leydig submetidas ao choque térmico a 43°C durante 15 minutos (Chen et al., 2010) (Controle 2). Estas células foram deixadas em temperatura ambiente (23±2 ºC) durante
2 horas para que a temperatura volte a ambiental e os fatores de estresse celular sejam expressos.
• Células de Leydig expostas ao inibidor da Hsp90 e submetidas ao choque térmico. Estas células também foram deixadas durante 2 horas em temperatura ambiente.
• Células de Leydig submetidas ao choque térmico deixadas durante 2 horas em temperatura ambiente. Foram obtidos registros controles e registros depois do tratamento com o inibidor da Hsp90. Estas células são controles delas mesmas.
A 17-Dimethylaminopropylamino-17-demethoxy-geldanamicina (17-DMAP-GA / Invivogen - USA) foi utilizada para a inibição da Hsp90 (Tian et al., 2004). A concentração da 17-DMAP-GA foi 10µM (Hinzpeter et al., 2006), considerada uma concentração alta para células isoladas.
Eletrofisiologia
Os experimentos foram realizados usando a técnica de patch clamp na configuração whole cell. O microscópio de contraste de fase (Nikon ELWD 0.3 - Japan) foi utilizado para visualização das células de Leydig e aproximação da pipeta na membrana plasmática. As correntes iônicas foram obtidas usando pipetas de vidro borosilicado (resistência de 2 a 4 MΩ - Sutter Instrument - USA), headstage (V203BU, Axon - USA), Axopatch 200B (Axon - USA) e placa de aquisição (Instrutec, NY - USA) . As correntes foram filtradas a 5 KHz e registradas no software (WINWCP v.4.3.3, Strathclyde Software).
Correntes de cálcio dos canais CaV3 tipo-T
A metodologia utilizada para análise das correntes nos canais de cálcio CaV3 tipo-T
seguiu as recomendações de Costa e Varanda (2007). As correntes foram obtidas aplicando-se pulsos de voltagem entre -80mV e +40mV com duração de 200ms e intervalos de 3 segundos entre os pulsos, mantidos num “holding” de -40mV. A solução que banhava externamente as células continha (mM): 126 NaCl, 5 KCl, 10 CaCl2, 1 MgCl2, 6 sódio lactato, 10 HEPES; pH
pipeta que entra em contato com o meio intracelular continha (mM): 130 CsCl, 0.8 MgCl2, 5
EGTA, 10 HEPES, 2 CaCl2, 2 ATP-Mg2+. A concentração de Ca+2 livre foi de 1.02x10-7 M. O
pH foi ajustado para 7,2 com CsOH, osmolaridade de 280-290 mosmol (kg H2O)-1.
Os picos das correntes normalizadas pela capacitância da membrana versus voltagens (curva I-V) foram ajustados pela função de Boltzmann:
) ( )) exp( 1 ( ) ( 0 max min min V Er K V V G G G i − − + − + = ,
onde: i = pico da corrente para cada voltagem; Gmin = condutância mínima; Gmax =
condutância máxima; V = voltagem; V0 = voltagem para a qual a metade dos canais estão
abertos ; K = fator da dependência de voltagem do sistema; Er = potencial de reversão.
As constantes de tempo da ativação (τativação) e inativação (τinativação) das correntes de
Ca2+ foram obtidas utilizando pulsos de -20mV em holding de -40mV através do ajuste da função:
C
e
A
t t f i n i i + − =∑
= τ / ) ( 1 ,onde Ai , C são os coeficientes e τi a constante de tempo das funções exponenciais que
descrevem a cinética do canal.
Correntes dos canais de potássio ativados por cálcio
As correntes através dos canais de potássio ativados por cálcio foram obtidas usando pulsos de voltagem de -80mV até +80mV com duração de 200ms intervalos de 3 segundos entre os pulsos, utilizando um holding de -40mV (300ms). A solução de banho continha (mM): 140 NaCl, 4.6 KCl, 1.6 CaCl2, 1.13 MgCl2, 10 D-glicose, 5 NaHCO3, 10 HEPES; pH
ajustado para 7,4 com KOH e osmolaridade de 290-310 mosmol (kg H2O)-1. A solução de
pipeta continha (mM): 150 KCl, 1 MgCl2, 5 EGTA, 10 HEPES, 3 CaCl2. A concentração de
Ca+2 livre foi 1x10-6 M . O pH foi ajustado para 7,4 com KOH, osmolaridade de 290-310 mosmol (kg H2O)-1.
As curvas I-V do estado estacionário da corrente de potássio dos canais BKCa também
) ( )) exp( 1 ( ) ( 0 max min max V Er K V V G G G i − − + − + = ,
onde: i = corrente no estado estacionário para cada pulso de voltagem; Gmin = condutância
mínima; Gmax = condutância máxima; V = voltagem; V0 = voltagem para qual a metade dos
canais estão abertos; K = fator da dependência de voltagem do sistema; Er = potencial de reversão.
A constante de tempo da ativação (τativação) da corrente de K+ foi obtida utilizando
pulso de +80mV em holding de -40mV através da mesma função descrita para os canais de Ca2+.
Transiente do cálcio intracelular
Células de Leydig aderidas em lamínulas cobertas com poly L-lisina foram carregadas com o indicador Fluo-3 AM 5 µM (Invitrogen – USA) durante 30 a 45 minutos em solução de Hanks. A análise do transiente do Ca2+ intracelular foi realizada através da detecção de fluorescência utilizando um microscópio confocal (SP5 Leica, Bensheim, Germany) de acordo com a metodologia descrita em Costa et al. (2010). A fluorescência foi normalizada (∆F) usando a função: min min) ( F F F F = − ∆ ,
onde: F = Fluorescência obtida; Fmin = Fluorescência mínima.
Imagens controle foram obtidas durante 70-80 segundos e depois o inibidor da Hsp90 foi aplicado durante 100-120 segundos. Foram analisadas 47 células de Leydig em dois experimentos independentes.
Análise Estatística
Os resultados obtidos foram expressos como média ± erro padrão. O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis com post-hoc de Dunn foi utilizado para analisar diferentes
células nos grupos pré-tratados por 2 horas com o choque térmico ou o inibidor da Hsp90. Para as células que foram controles delas mesmas foi utilizado o teste não paramétrico pareado de Wilcoxon. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para p < 0.05.
Resultados
Correntes de cálcio dos canais CaV3 tipo-T
Os resultados obtidos demonstraram que a dependência de voltagem e o pico da corrente dos canais de cálcio não foram alterados devido a exposição ao choque térmico (Figuras 1A, 1C e 1D). A aplicação imediata do inibidor da Hsp90 (Figura 1B) e a inibição da Hsp90 durante 2 horas não alteraram as correntes dos canais de cálcio tanto nas células expostas ao choque térmico (Figura 1F) quanto nas células normais (Figura 1E).
Os parâmetros da cinética dos canais CaV3 tipo-T obtidos pelo ajuste da função de
Boltzmann não se alteraram em função dos tratamentos experimentais (Tabelas 1 e 2). As constantes de tempo da ativação e inativação dos canais de Ca2+ também não foram afetadas pelo estresse térmico ou inibição da Hsp90.
Na Figura 2 pode-se observar que a aplicação do inibidor da Hsp90 não alterou a corrente dos canais CaV3 tipo-T obtidas em resposta a pulsos de voltagem de -20 mV.
Figura 1. Correntes dos canais de cálcio CaV3 tipo-T de células de Leydig obtidas usando
pulsos de voltagem de -80mV a +40mV. 1A: Relação I-V nas células controle ou expostas ao choque térmico (HS) e/ou a geldanamicina (inibidor da Hsp90) durante 2 horas (nCont = 22,
nGA = 23, nHS = 20, nHSGA = 19). 1B: Relação I-V dos canais CaV3 tipo-T nas células de
Leydig tratadas com a geldanamicina logo após o registro controle (nCont = 10, nGA = 10, nHS =
10, nHSGA = 10). 1C: Registro controle de correntes geradas por canais CaV3 tipo-T. 1D:
Correntes de canais CaV3 tipo-T 2 horas após o estresse térmico. 1E: Correntes de canais
CaV3 tipo-T em células não expostas ao choque térmico e tratadas com a geldanamicina
durante 2 horas. 1F: Correntes de canais CaV3 tipo-T 2 horas após o choque térmico e a
exposição a geldanamicina. Cont: Controle, GA: Exposto a geldanamina, HS: Exposto ao choque térmico, HSGA: Exposto ao choque térmico e a geldanamicina.
A B
C D
Figura 2. Corrente dos canais CaV3 tipo-T de células de Leydig em resposta a pulsos de
voltagem de -20mV em holding de -40mV. Os valores foram normalizados pela corrente média. Aplicação da geldanamicina (inibidor da Hsp90) na seta. (Cont: Controle, n = 5; GA: Exposto a geldanamicina, n = 5).
Tabela 1. Parâmetros da cinética da corrente dos canais CaV3 tipo-T em células de Leydig
submetidas ou não ao estresse celular induzido pelo choque térmico e/ou ao pré-tratamento com 10µM de 17-DMAP-GA durante 2 horas (R2médio = 0.99).
Tabela 2. Parâmetros da cinética das correntes dos canais CaV3 tipo-T em células de Leydig
submetidas ou não ao choque térmico. O tratamento com 10µM de 17-DMAP-GA foi realizado logo após o registro controle. Estas células são controles delas mesmas, foi realizado o teste pareado de Wilcoxon (R2médio = 0.99).
Não Expostas ao Choque
Térmico Expostas ao Choque Térmico
Controle GA 10µM Controle GA 10µM p Gmin (nS/pF) 0.05 ± 0.003 0.05 ± 0.002 0.05 ± 0.002 0.06 ± 0.002 0.84 Gmax (nS/pF) 0.11 ± 0.006 0.11 ± 0.004 0.11 ± 0.004 0.11 ± 0.004 0.83 V0 (mV) -32.9 ± 0.5 -32.7 ± 0.4 -31.6 ± 0.4 -31.3 ± 0.3 0.06 K 5.0 ± 0.1 5.2 ± 0.1 5.0 ± 0.1 5.5 ± 0.1 0.10 Er (mV) 30.7 ± 1.0 28.9 ± 0.7 32.1 ± 1.1 29.7 ± 0.7 0.17
τ
ativação (ms) 3.4 ± 0.2 3.2 ± 0.1 3.8 ± 0.1 3.7 ± 0.1 0.06τ
inativação (ms) 17.5 ± 0.9 16.9 ± 1.0 19.5 ± 1.2 17.2 ± 1.7 0.49Correntes de potássio nos canais BKCa
As correntes nos canais BKCa reduziram 49,8% nas células de Leydig expostas ao
choque térmico (Figura 3). Entretanto, as correntes nos canais BKCa não foram afetadas pelo
pré-tratamento com o inibidor da Hsp90 durante 2 horas (Figuras 3A e 3E) ou sua aplicação nas células logo após o registro controle (Figura 3B). As células de Leydig submetidas ao choque térmico e a inibição da Hsp90 apresentaram um comportamento semelhante às células expostas apenas à temperatura elevada (Figura 3F), indicando que apenas o choque térmico alterou a cinética dos canais BKCa.
Os parâmetros obtidos pelo ajuste da função de Boltzmann para as correntes no estado estacionário dos canais BKCa mostraram que a condutância máxima reduziu 68,9% nas células
expostas à temperatura elevada em relação às células controle (Tabela 3). O parâmetro V0 foi
30% maior no grupo exposto à temperatura elevada (Tabela 3), indicando uma ativação mais lenta dos canais BKCa em resposta aos pulsos de voltagem. As células pré-tratadas com o
inibidor da Hsp90 durante 2 horas ou expostas ao inibidor logo após o registro controle não mostraram alterações nos parâmetros analisados (Tabelas 3 e 4). A constante de tempo da ativação dos canais BKCa foi 31,9% maior nas células submetidas ao choque térmico, também
indicando uma ativação mais lenta dos canais BKCa.
Não Expostas ao Choque Térmico Expostas ao Choque Térmico Controle GA 10µM p Controle GA 10µM p Gmin (nS/pF) 0.05 ± 0.004 0.05 ± 0.004 0.72 0.04 ± 0.004 0.04 ± 0.002 0.13 Gmax (nS/pF) 0.10 ± 0.009 0.10 ± 0.009 0.05 0.09 ± 0.008 0.08 ± 0.01 0.13 V0 (mV) -31.8 ± 1.0 -33.1 ± 0.8 0.05 -28.8 ± 0.7 -29.1 ± 0.8 0.42 K 5.4 ± 0.2 4.9 ± 0.1 0.25 5.2 ± 0.2 4.9 ± 0.1 0.16 Er (mV) 30.3 ± 1.6 31.2 ± 2.0 0.35 34.1 ± 1.7 34.3 ± 1.5 0.65
τ
ativação (ms) 3.3 ± 0.3 3.0 ± 0.4 0.12 4.8 ± 0.3 4.6 ± 0.2 0.97τ
inativação (ms) 15.2 ± 1.8 14.5 ± 1.8 0.30 20.6 ± 1.8 21.2 ± 2.2 0.30O tratamento das células de Leydig com o inibidor da Hsp90 não alterou a corrente nos canais BKCa em resposta a pulsos de voltagem de +80mV (Figura 4).
Figura 3. Correntes dos canais BKCa de células de Leydig obtidas usando pulsos de voltagem
de -80mV a +80mV. 1A: Relação I-V nas células controle ou expostas ao choque térmico (HS) e/ou à geldanamicina (inibidor da Hsp90) durante 2 horas (nCont = 10, nGA = 10, nHS = 10,
nHSGA = 10). 1B: Relação I-V dos canais BKCa nas células tratadas com a geldanamicina logo
após o registro controle (nCont = 10, nGA = 10, nHS = 10, nHSGA = 10). 1C: Registro controle de
correntes geradas por canais BKCa. 1D: Correntes de canais BKCa 2 horas após o choque
térmico. 1E: Correntes de canais BKCa em células não estressadas e expostas a geldanamicina
durante 2 horas. 1F: Correntes de canais BKCa 2 horas após o choque térmico e exposição à
geldanamicina. Cont: Controle, GA: Exposto a geldanamina, HS: Exposto ao choque térmico, HSGA: Exposto ao choque térmico e a geldanamicina.
A B
C D
F E
Figura 4. Corrente dos canais BKCa de células de Leydig em resposta a pulsos de voltagem
de +80mV em holding de -40mV. Os valores foram normalizados pela corrente média. Aplicação da geldanamicina (inibidor da Hsp90) na seta. (Cont: Controle, n = 6; GA: Exposto a geldanamicina, n = 8).
Tabela 3. Parâmetros da cinética da corrente dos canais BKCa em células de Leydig
submetidas ou não à temperatura elevada e/ou ao pré-tratamento com 10µM de 17-DMAP- GA durante 2 horas (R2médio = 0.99).
* Estatisticamente significativo.
Tabela 4. Parâmetros da cinética das correntes dos canais BKCa em células de Leydig
submetidas ou não ao choque térmico. O tratamento com 10µM de 17-DMAP-GA foi realizado logo após o registro controle. Estas células são controles delas mesmas, foi realizado o teste pareado de Wilcoxon (R2médio = 0.99).
Não Expostas ao Choque Térmico Expostas ao Choque Térmico Controle GA 10µM Controle GA 10µM p Gmin (nS/pF) 0.02 ± 0.007 0.03 ± 0.008 0.02 ± 0.011 0.02 ± 0.005 0.95 Gmax (nS/pF) 1.0 ± 0.3a 0.7 ± 0.2a 0.2 ± 0.06b 0.2 ± 0.07b 0.004* V0 (mV) 81.5 ± 4.3a 85.2 ± 16.5a 120.5 ± 5.9b 117.7 ± 3.0b 0.000* K 11.6 ± 1.2 12.2 ± 2.5 9.4 ± 1.2 9.6 ± 0.9 0.51 Er (mV) -39.3 ± 0.8 -40.3 ± 1.1 -40.4 ± 0.4 -41.3 ± 0.9 0.78
τ
ativação (ms) 14.5 ± 1.3 14.9 ± 1.2 19.1 ± 1.5 20.6 ± 3.6 0.20No presente estudo, as correntes de Ca2+ e K+ estão de acordo com as observadas anteriormente por Costa e Varanda (2007) e Desaphy et al. (1996), indicando que os procedimentos experimentais foram realizados com sucesso.
Transiente do cálcio intracelular
A exposição das células de Leydig ao inibidor da Hsp90 (17-DMAP-GA) não alterou o transiente do cálcio intracelular (Figura 5). Devido a limitações técnicas, não foi possível avaliar o transiente do cálcio intracelular nos animais expostos ao choque térmico.
Figura 5. Transiente do cálcio intracelular em célula de Leydig antes e depois da aplicação de 10 µM de 17-DMAP-geldanamicina (inibidor da Hsp90). Barra de escala: 10 µm, s: segundos.
Não Expostas ao Choque Térmico Expostas ao Choque Térmico Controle GA 10µM p Controle GA 10µM p Gmin (nS/pA) 0.02 ± 0.002 0.02 ± 0.002 0.92 0.02 ± 0.002 0.02 ± 0.005 0.98 Gmax (nS/pA) 0.7 ± 0.07 0.7 ± 0.1 0.92 0.2 ± 0.05 0.2 ± 0.08 0.35 V0 (mV) 73.3 ± 2.7 74.4 ± 3.4 0.92 77.2 ± 2.8 83.9 ± 7.7 0.65 K 9.6 ± 0.9 11.8 ± 0.8 0.16 13.1 ± 3.0 11.0 ± 1.5 0.97 Er (mV) -38.2 ± 0.9 -37.4 ± 0.9 0.76 -44.4 ± 3.2 -40.7 ± 1.5 0.42
τ
ativação (ms) 15.0 ± 1.0 13.8 ± 1.1 0.23 19.5 ± 2.2 18.4 ± 1.4 0.96 0s 1s 3s 6s 15s 35s 60sDiscussão
A entrada e saída de íons na célula através de canais na membrana plasmática servem como sinalização para diversos processos fisiológicos, patológicos e toxicológicos (Restrepo- Angulo et al., 2010). Apesar dos canais iônicos das células de Leydig possuírem grande importância para a sinalização celular e esteroidogênese, não foram encontrados estudos anteriores que avaliassem o comportamento destes canais em condições celulares adversas; bem como o efeito dos fatores de estresse celular nos canais iônicos das células de Leydig.
Efeito do choque térmico nos canais CaV3 tipo-T e BKCa das células de Leydig
Identificar processos relacionados ao estresse celular, termo-resistência e esteroidogênese nas células de Leydig é importante na investigação de possíveis alvos terapêuticos visando a manutenção da fertilidade.
As respostas do estresse celular são mecanismos universais de extraordinária significância fisiológica e patológica. Estas respostas representam reações de defesa das células a danos ambientais em suas macromoléculas. Apesar de diversos fatores estarem envolvidos na resposta das células ao estresse celular, vários aspectos dessa resposta não são específicos ao agente estressante, pois as células monitoram o estresse baseada no dano a macromoléculas sem relação a que tipo de estresse causou o dano celular (Herr e Debatin, 2001; Kültz, 2005).
Atualmente sabe-se que a exposição ocupacional ao calor pode reduzir a fertilidade (Bonde, 2010). O calor é um dos fatores que induzem a degeneração testicular, com conseqüente perda da função normal dos testículos (Turner, 2007). Apesar de alguns estudos relatarem que as células de Leydig e a produção de testosterona podem ser alteradas em condições adversas que levem ao estresse celular, tais como o calor (Murphy et al., 2001; Gorostizaga et al., 2005; Kurowicka et al., 2007; Aktas e Kanter, 2009), hipóxia (Farias et al., 2008) e estresse oxidativo (Gautam et al., 2006); a literatura geralmente considera que as células de Leydig e a esteroidogênese não são diretamente afetadas pelo calor, sendo células termo-resistentes (Setchell, 2006). Os mecanismos celulares envolvidos na termo-resistência das células de Leydig ainda não estão totalmente esclarecidos.
No presente trabalho foi observado que o estresse térmico de 43ºC durante 15 minutos não alterou a corrente de Ca2+, mas alterou a corrente de K+. Os canais de KCa existem em
células excitáveis e não excitáveis. Estes canais estão envolvidos em diversos processos celulares: excitabilidade neuronal; função no tecido muscular liso; secreção hormonal; imunidade inata; modulação do tônus vascular (Ghatta et al., 2006) e esteroidogênese nas células de Leydig (Carnio e Varanda, 1995).
A atividade dos canais BKCa nas células de Leydig é muito sensível a concentração do
Ca2+ intracelular (Carnio e Varanda, 1995). Tendo em vista que o aumento do Ca2+ intracelular pode desencadear respostas que culminam em apoptose e diversos processos induzidos pelo estresse celular podem causar proteção através da redução do Ca2+ intracelular (Mattson, 2007); é possível que a redução na corrente nos canais BKCa observada no presente
trabalho tenha ocorrido devido a redução do Ca2+ intracelular nas células de Leydig submetidas ao choque térmico.
O estresse térmico pode proteger a função celular inibindo as correntes de K+ (Robertson, 2004). O K+ participa do inicio, meio e fim do processo apoptótico; o efluxo de K+ através da membrana plasmática causa a redução do volume celular durante a apoptose, o que é um marco inicial necessário para o disparo do processo apoptótico (Burg et al., 2006). Considerando que a apoptose pode ser atenuada através da inibição dos canais de K+ (Yu et al., 1997), nós sugerimos a hipótese de que a redução da corrente de K+ observada no presente estudo seja um mecanismo contra a apoptose nas células de Leydig, promovendo proteção e resistência contra o estresse térmico.
Segundo Armstrong e Robertson (2006), os mecanismos reguladores de K+ podem ser a primeira linha de defesa contra o estresse térmico. Os resultados observados em nosso estudo corroboram com os obtidos por Ramirez et al. (1999), Wu et al (2002) e Robertson (2004), onde o estresse térmico reduziu as correntes de potássio. Intrigantemente, Hoag et al. (1997), Joyeux et al. (1998), Wu et al. (2001) e Duncker e Verdouw (2000) citaram que a ativação das correntes de K+ protegem a função de células nervosas e cardiomiócitos. Saad e Hahn (1992) também observaram a ativação dos canais de K+ em linhagens de células termo-