• Nenhum resultado encontrado

Estudos de localização subcelular em Leishmania mexicana mexicana

3.9. Localização celular

3.9.3. Estudos de localização subcelular em Leishmania mexicana mexicana

mexicana promastigotas

Os estudos de localização subcelular para as duas isoformas da enzima LmFH foram realizados em colaboração com o Prof. Paul Michels, da Research Unit for Tropical Diseases, de Duve Institute, Université Catholique de Louvain em Bruxelas na Bélgica.

Materiais e Métodos

36

(a) Parasitos

Os parasitos Leishmania mexicana mexicana promastigotas (MHOM/BZ/84/BEL46) foram cultivados in vitro a 28°C em meio semi-definido (SDM-79) suplementado com soro fetal bovino 10% (FCS).

(b) Fracionamento celular com digitonina

As células de Leishmania mexicana na forma promastigota foram centrifugadas a 2.000 rpm por 10 minutos, lavadas duas vezes com tampão SHE (HEPES 25 mM pH 7,4, sacarose 250 mM, EDTA 1 mM) contendo coquetel de inibidor de protease (pepstatina 1 M, leupeptina 1 M, AEBSF 10 M, EDTA 100 M) e ressuspendidas em 1 mL da mesma solução tampão. Em seguida, 100 L de células foram incubadas com triton X-100 0,1% (v/v) a 4°C por 20 minutos e a concentração total de proteína foi estimada pelo método de Bradford. Uma vez determinada a concentração de proteína total, para o experimento de fracionamento com o detergente digitonina, alíquotas de células contendo 300 g de proteína foram diluídas em tampão HBSS (CaCl2 1,3 mM, KCl 5 mM, KH2PO4 0,3 mM,

MgCl2 0,5 mM, MgSO4 0,4 mM, NaCl 138 mM, NaHCO3 4 mM, NaHPO4 0,3 mM, HEPES 15

mM pH 7,1) e digitonina (0,01 a 1 mg digitonina / mg proteína) em um volume final de 300 L. As células foram incubadas a 25°C por 4 minutos e centrifugadas a 13.000 rpm por 2 minutos a 4°C. Como controle total de lise da célula, o parasito foi incubado com Tritron X-100 0,1% (v/v) em tampão HBSS por 20 minutos a 4ºC. Os sobrenadantes e frações insolúveis (ressuspendidos em 300 L de tampão HBSS) obtidos a partir do fracionamento celular com digitonina foram utilizados para realizar Western blotting e para determinar a atividade das enzimas hexokinase (controle glicossomal), enolase (controle citosólico) e fumarase, a proteína de estudo.

(c) Western blotting

As frações solúveis e insolúveis obtidas do fracionamento com digitonina e triton X-100 foram analisadas por eletroforese SDS-PAGE 10% e as bandas separadas foram

Materiais e Métodos

37

transferidas para membrana de nitrocelulose aplicando-se uma voltagem de 70 V por 70 minutos a 4°C. Após a transferência, as membranas de nitrocelulose foram incubadas com tampão PBS contendo leite 5% (m/v) por 12 horas a 4°C, e posteriormente lavadas 3 vezes de 10 minutos com tampão PBS a temperatura ambiente sob agitação. Em seguida, as membranas foram incubadas com anticorpo primário (anti-LmFH-1, anti-

LmFH-2 e anti-TIM) diluídos em tampão PBS contendo leite 1% (m/v), por 1 hora a

temperatura ambiente sob agitação. A proteína TIM foi utilizada como controle glicossomal. Após incubar com anticorpo primário, as membranas foram lavadas 3 vezes de 10 minutos com tampão PBS seguida de uma lavagem de 10 minutos com tampão PBS contendo NP-40 0,05% (v/v) e novamente 3 vezes de 10 minutos com tampão PBS, a temperatura ambiente sob agitação. O anticorpo secundário anti-IGg de coelho conjugado com peroxidase horseradish (HRP), diluído 1:10.000 em tampão PBS contendo leite 1% (m/v), foi incubado com as membranas por 1 hora a temperatura ambiente sob agitação. Em seguida, realizou-se outro processo de lavagem da mesma forma descrita anteriormente, alternando entre as 3 lavagens com PBS uma lavagem com PBS contendo NP-40. Após as lavagens, as membranas foram incubadas por 1 minuto com a solução reveladora “ECL Western blotting system” (Pierce), montadas em papel filme no cassete de autoradiografia para exposição e os anticorpos primários marcados foram visualizados em filme fotográfico.

(d) Atividade enzimática

As frações solúveis obtidas do fracionamento com digitonina (0,01 a 1 mg digitonina/mg proteína) e triton X-100 0,1% (v/v) foram utilizadas para determinar a atividade enzimática das enzimas hexokinase (controle glicossomal), enolase (controle citosólico) e fumarase, a proteína de estudo. Os ensaios espectrofotométricos foram realizados a 25°C de acordo com o protocolo de atividade de cada enzima.

A enzima hexokinase é responsável por catalisar a reação: D-glicose + Mg-ATP  D-glicose-6-P + Mg-ADP

Materiais e Métodos

38

E a enzima glicose-6P-desidrogenase catalisa a reação:

D-glicose-6-P + NADP+  D-gluconato-6-P + NADPH + H+

Os ensaios de atividade para a enzima hexokinase foram realizados indiretamente através do monitoramento da formação de NADPH a 340 nm por 10 minutos. A reação foi iniciada pela adição de 0,7 U de glicose-6P-desidrogenase em solução tampão TEA 0,1 M pH 7,6, MgCl2 10 mM, NADP 0,6 mM, glicose 10 mM, ATP 0,75 mM, adicionado de 5 L

de cada amostra solúvel obtida do fracionamento com digitonina e triton X-100, em um volume final de 1 mL.

A enzima enolase catalisa a reação:

Glicerato-2-P  PEP + H2O

Os experimentos de atividade para enolase foram realizados através do monitoramento da formação do produto da catálise, PEP (fosfoenolpiruvato), a 240 nm por 10 minutos. A reação foi iniciada pela adição de glicerato-2-P 1 mM a uma solução tampão TEA 0,1 M pH 7,4, MgSO4 5 mM, KCl 0,1 M adicionado de 5 L de cada amostra

solúvel obtida do fracionamento com digitonina e triton X-100, em um volume final de 1 mL.

Os ensaios de atividade para a enzima fumarase foram realizados de acordo com o protocolo descrito no item 3.6.2, utilizando S-malato 12 mM como substrato e 5 L de cada amostra solúvel obtida do fracionamento com digitonina e triton X-100.

(e) Microscopia confocal

As células de Leishmania mexicana mexicana foram inicialmente preparadas para os estudos de imunofluorescência por microscopia confocal de forma a introduzir um marcador mitocondrial Mito Tracker Red CMXRos (Molecular Probes). Para isso, adicionou-se 500 L de cultura de L. mexicana mexicana em 3 poços de placa de cultura, adicionou-se 1,5 L de Mito Tracker a 100 nM (concentração final de 0,3 nM) em cada poço e incubou-se a placa por 30 minutos a 28°C. Após este período, as células foram centrifugadas a 2.000 rpm por 5 minutos a 4°C, ressuspendidas em 1 mL de meio de cultura SDM-79 e incubadas novamente por 30 minutos a 28°C. Em seguida, as células

Materiais e Métodos

39

foram centrifugadas a 3.000 rpm por 5 minutos a 4°C, ressuspendidas em 125 L de tampão PBS, adicionadas de 125 L de PBS contendo formaldeído 8%, utilizado para fixação das células, e incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente sob leve agitação. Após o tempo de incubação, foram adicionados às células 200 L de PBS, 50 L de PBS contendo Triton X-100 10% (v/v), utilizado para permeabilizar a célula, e as células foram incubadas novamente sob leve agitação por 15 minutos. Em seguida, adicionou-se 130 L de glicina em PBS 0,5 M, para fixar o formaldeído ou remover o formaldeído que resta, e incubou-se as células por 12 horas a 4°C sob leve agitação. Após este período, as células foram centrifugadas a 3.000 rpm por 5 minutos a 4°C e ressuspendidas em 500 L de tampão PBS.

As lâminas utilizadas para fixar os parasitos foram previamente preparadas através de lavagens dos poços com água quente, etanol e água destilada, seguidas da adição de 10 L de poli-lisina 10 mg/mL por poço. Em seguida, as lâminas foram incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente em um ambiente úmido, lavadas com água destilada e secadas por 15 minutos a 37°C.

Para os estudos de imunofluorescência, as lâminas foram preparadas adicionando- se 10 L de células de Leishmania mexicana previamente preparadas em cada poço e fixadas por 1 hora a temperatura ambiente. Em seguida, foi eliminado o excesso de PBS de cada poço, adicionouu-se 15 L de solução de bloqueio BSA 5% (m/v) em tampão PBS e a lâmina foi incubada por 45 minutos a 37°C. Após este período, o excesso de solução foi retirado, 10 L de anticorpo primário (anti-LmFH-1 e anti-LmFH-2), diluídos em BSA 2% (m/v) em tampão PBS, foram adicionados em cada poço e as lâminas foram incubadas novamente por 45 minutos a 37°C. Em seguida, foram realizadas 6 lavagens de 5 minutos com 50 L de tampão PBS a temperatura ambiente. Após as lavagens, foi adicionado em cada poço 10 L de anticorpo secundário (Alexa Flur® 488 anti-IgG de coelho com fluorescência verde (Molecular Probes)) contendo TOPRO (marcado azul de DNA) na diluição 1:1000, diluídos em BSA 2% (m/v) em tampão PBS, e as lâminas foram incubadas novamente por 45 minutos a 37°C. As lâminas foram lavadas 6 vezes de 5 minutos com 50 L de PBS e mergulhadas em soluções de etanol 70, 85 e 96% para

Materiais e Métodos

40

desidratar e melhorar a fixação dos parasitos. Em seguida, as lâminas foram secadas sobre um fluxo de ar e adicionou-se 35 a 40 L de mowiol entre os poços para selar utilizando uma lamínula, sem formar bolhas. Todos os passos foram realizados em ambiente úmido e escuro, porém as lâminas foram guardadas apenas em ambiente escuro.

Os estudos de localização celular através da técnica de imunofluorescência usando microscopia confocal foram realizados em um microscópio confocal Zeiss Axiovert acoplado com um sistema de varredura de imagem a laser MRC-1024 (Bio Rad), onde os parasitos foram visualizados e as imagens foram capturadas. As imagens foram tratadas no programa ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).

Resultados e Discussões

42

Documentos relacionados