HEXANO CHCl3 MeOH FOLHAS (345,0g) ↓ EXTRATO BRUTO ( 60,0g) ↓ LCF-2 LCF-3 LCF-4 AcOEt LC-7 4,0 mg LC-4 11,0 mg Ppt CHCl3 / H2O (sucessivas lavagens)
3.2.3.2 – Tratamento da fração LCF-2 (Fração clorofórmica)
Parte da fração LCF-2 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 (∅= 2,0cm e msi = 20,0g) empacotada com hexano e eluída com
hexano/acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 64 frações de 15,0mL cada, reunidas em 8 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 8.
Tabela 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2
Frações reunidas
Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância isolada 1-14 Hexano/AcOEt 2,5-7,0 173,6 LCF-2.1 15-22 Hexano AcOEt 10,0 114,8 LCF-2.2 LC-1 23-27 Hexano/ AcOEt 10,0 160,0 LCF-2.3 28-34 Hexano/ AcOEt 15,0 106,3 LCF-2.4 LC-2 35-44 Hexano/ AcOEt 20,0-25,0 220,8 LCF-2.5 45-53 Hexano/ AcOEt 50,0-75,0 215,4 LCF-2.6 54-55 AcOEt 49,1 LCF-2.7 56-64 AcOEt 42,7 LCF-2.8
Na fração LCF-2.2 foi detectada a presença de LC-1 e na fração LCF-2.4 LC-2. As frações LCF-2.6 e LCF-2.7 foram reunidas por apresentarem semelhanças. Esta fração foi denominada LCF-2.6 (264,0mg), e foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 10,0g) empacotada
com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 55 frações de 15,0mL cada, reunidas em 5 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 9.
Tabela 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6
Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação
1-8 CHCl3 88,0 LCF-2.6.1
9-17 CHCl3/MeOH 2,5 160,0 LCF-2.6.2
18-24 CHCl3/MeOH 2,5-5,0 4,0 LCF-2.6.3
25-48 CHCl3/MeOH 7,0-40,0 2,3 LCF-2.6.4
49-55 CHCl3/MeOH 40,0-80,0 1,0 LCF-2.6.5
A fração LCF-2.6.2 (160,0mg), por apresentar fluorescência sob luz ultravioleta no comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 8,0g) empacotada com
clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 43 frações de 15,0mL cada, reunidas em 4 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 10.
Tabela 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6.3
Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação
1-11 CHCl3 14,0 LCF-2.6.3 a
12-18 CHCl3/MeOH 1,0 76,0 LCF-2.6.3 b
19-38 CHCl3/MeOH 1,5-2,5 52,6 LCF-2.6.3 c
38-43 CHCl3/MeOH 5,0 3,0 LCF-2.6.3 d
A fração LCF-2.6.3b (76,0mg), por apresentar perfil cromatográfico menos complexo foi submetida a uma cromatografia em camada delgada preparativa(CCDP). Foram retiradas quatro faixas sendo que apenas uma apresentou quantidade de massa suficiente para análises espectroscópicas, sendo denominada LCF-2.6b (4,0mg).
3.2.3.3 – Tratamento da fração LCF-3 (Fração acetato de etila)
A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol ,para removê-la do balão, houve a formação de um precipitado de coloração
amarela. A análise por CCDA apresentou duas manchas com rfs diferentes, uma
de cor amarela e outra de cor violeta sob luz visível. As substâncias foram separadas utilizando-se clorofórmio e água. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram que uma substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a qual foi denominada de LC-7 (8,0 mg) e a outra substância era o esteróide já isolado (LC-4) (11,0 mg). Optou-se por não fazer coluna cromatográfica da fração LCF-3 por apresentar perfil intermediário entre a fração clorofórmica(LCF-2) e a fração metanólica(LCF-4).
3.2.3.4 – Tratamento da fração LCF-4 (Fração metanólica)
Parte da fração LCF-4 (4,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de silica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 50,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com
clorofórmio/acetato de etila/ metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 72 frações de 15,0mL cada, reunidas em 7 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 11.
Tabela 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4
Frações reunidas
Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância isolada 1-33 CHCl3/ AcOEt 10,0-50,0 42,5 LCF-4.1 34-40 AcOEt /MeOH 5,0-10,0 104,8 LCF-4.2 41-50 AcOEt /MeOH 20,0 84,6 LCF-4.3 LC-7 51-52 AcOEt /MeOH 30,0 45,0 LCF-4.4 53-57 AcOEt /MeOH 50,0 87,2 LCF-4.5 58-64 AcOEt /MeOH 50,0-75,0 104,8 LCF-4.6 65-72 MeOH 178,0 LCF-4.7
Na fração LCF-4.2 foi detectado através de CCDA, uma mancha de coloração amarela sob luz visível. Esta fração foi purificada com acetato de etila
não tendo sido obtido quantidade de massa suficiente para as análises espectroscópicas. Na fração LCF-4.3 foi isolada mais quantidade da substância LC-7 (4,0 mg). As demais frações não foram estudadas por apresentarem um perfil cromatográfico muito complexo.
A fração LCF-1 não foi estudada por apresentar pouca massa e perfil cromatográfico muito complexo.
3.3 – Estudo de atividade biológica
Os testes de atividade antifúngica e antibacteriana foram realizados no Departamento de Análises Clínicas da Universidade Estadual de Maringá, sob coordenação do professor Dr. Benedito Dias Prado Filho e professor Dr. Celso Nakamura. O método usado nos testes foi o da microdiluição descrito por Woods (1995).
A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada no CPQBA (UNICAMP), sob responsabilidade do professor Dr. João Ernesto de Carvalho. Os testes de atividade foram realizados segundo método descrito por Skehan e col. (1990) e Monks e col. (1991).
3.3.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e das folhas
A avaliação da atividade antibacteriana foi feita através do teste de susceptibilidade antibacteriana pelo método de microdiluição. Este método utiliza placas contendo 96 compartimentos, sendo cada compartimento denominado well (poço). Foram utilizadas três placas para verificar a atividade antibacteriana, uma para cada espécie de bactéria, juntamente com os respectivos antibacterianos padrões descritos pela literatura. Cada poço continha aproximadamente 10 μL de caldo de cultura Müller-Hinton para crescimento bacteriano. As drogas utilizadas (padrões e testes) foram diluídas em dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração de 20 mg/mL. Após sucessivas diluições do extrato e das frações em meio de
cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se concentração de 2000 μg/mL. A partir dessa concentração foi retirada uma alíquota de 100 μL e iniciou-se a inoculação da droga em sucessivos compartimentos com meio de cultura. As diluições ocorreram no sentido das colunas, uma para cada droga. Ao ser adicionada em um compartimento este era homogeneizado com a mesma pipeta, sendo transferida uma quantidade igual a 100 μL para o poço seguinte. Dessa forma, cada compartimento anterior tinha o dobro da concentração do posterior. O primeiro poço da primeira coluna, portanto, ficou com a primeira droga teste numa concentração de 1000 μg/mL, o segundo com 500 μg/mL, o terceiro com 250 μg/mL, o quarto com 125 μg/mL, o quinto com 62,5 μg/mL, o sexto com 31,75 μg/mL e o último com aproximadamente 15,85 μg/mL. As placas de microdiluição foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi feita, considerando o CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano.
A concentração mínima bactericida foi determinada retirando uma alíquota de 10 μL (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a droga, mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio de cultura ágar Mueller Hinton, devidamente identificadas. A Concentração Mínima Bactericida (CMB) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga que impediu o crescimento visível do subcultivo.
Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente as bactérias Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6623 e Escherichia coli ATCC 25922, utilizando-se como padrões os antibacterianos penicilina, vancomicina e tetraciclina, respectivamente.
3.3.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos
A avaliação utilizou o teste de susceptibilidade antifúngica pelo método de microdiluição. Este método utiliza placas contendo 96 compartimentos, sendo cada compartimento denominado well (poço). Foram utilizadas quatro placas para verificar a atividade antifúngica, uma para cada espécie de fungo, juntamente com
o antifúngico padrão descrito pela literatura. Cada poço continha aproximadamente 10 μL de caldo de cultura RPMI-1640 da Sigma® para
crescimento fúngico. As drogas utilizadas (padrão e testes) foram diluídas em dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração de 20 mg/mL. Após sucessivas diluições do extrato em meio de cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se concentração de 2000 μg/mL. A partir dessa concentração foi retirada uma alíquota de 100 μL e iniciou-se a inoculação da droga em sucessivos compartimentos com meio de cultura. As diluições ocorreram no sentido das colunas, uma para cada droga. Ao ser adicionada em um compartimento este era homogeneizado com a mesma pipeta, sendo transferida uma quantidade igual a 100 μL para o poço seguinte. Dessa forma, cada compartimento anterior tinha o dobro da concentração do posterior. O primeiro poço da primeira coluna, portanto, ficou com a primeira droga teste numa concentração de 1000 μg/mL, o segundo com 500 μg/mL, o terceiro com 250 μg/mL, o quarto com 125 μg/mL, o quinto com 62,5 μg/mL, o sexto com 31,75 μg/mL e o último com aproximadamente 15,85 μg/mL. As placas de microdiluição foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi feita, considerando o CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico.
A concentração mínima fungicida (CMF) foi determinada retirando uma alíquota de 10 μL (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a droga, mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio de cultura ágar Sabourand, devidamente identificadas. A concentração mínima fungicida (CMF) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga que impediu o crescimento visível do subcultivo.
A droga padrão foi a micostatina e a incubação foi realizada em estufa bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi realizada considerando a CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico.
Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente aos fungos Candida albicans, C. parapsilosis, C. krusei e C. tropicalis utilizando-se como antifúngico padrão a micostatina.
3.3.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa dos extratos brutos das folhas e suas frações, do extrato bruto dos galhos e suas frações
As linhagens celulares cedidas pelo National Cancer Institute (NCI) dos Estados Unidos da América, e utilizadas na triagem da atividade antiproliferativa foram diluídas em dimetilsulfóxido de sódio (DMSO) na concentração de 1g/mL resultando em soluções estoques.
Para o teste de atividade, foram plaqueados 100 μl de células em meio RPMI/SFB/ gentamicina, nas suas respectivas densidades de inoculação, em placas de 96 compartimentos. As placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido, para readaptação ao ambiente. Após
esse período uma placa controle foi fixada através da adição de ácido tricloroacético para determinação da quantidade de células no momento da adição das drogas. Nas demais placas foram adicionadas as drogas nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 ug/mL e incubadas por 48 horas, centrifugadas por 3 minutos a 2000 rpm, e fixadas com 50 μl de ácido tricloroacético a 50% (TCA) para as células aderidas e 80% para as células em suspensão (leucemia). Para completar a fixação celular, as placas foram incubadas por 1 hora a 4ºC, submetidas a quatro lavagens com água destilada para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários e mantidas em temperatura ambiente até a secagem completa. As placas foram coradas pela adição de 50μl do corante proteico sulforrodamina B (SRB) a 0,4 % (peso/volume), dissolvido em ácido acético a 1 %, e incubadas a 4 ºC, durante 30 minutos e lavadas por 4 vezes com uma solução de ácido acético 1%. O resíduo da solução de lavagem foi removido das placas, as quais foram secas à temperatura ambiente. O corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com uma solução de Trizma Base na concentração de 10μM e pH 10,5 por 5 minutos em ultra-som. A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 560 nm em um leitor de microplacas. Para análise dos resultados, foram calculadas as médias das absorbâncias descontadas de seus respectivos brancos, e calculada a porcentagem de inibição de crescimento. Com os dados obtidos, foram construídos gráficos relacionando a porcentagem de inibição de crescimento com
a concentração da substância teste. Como controle positivo foi padronizado o quimioterápico doxorrubicina Os testes foram realizados com os extratos brutos das folhas e galhos e frações, avaliados frente a um painel de células tumorais humanas composto pelas linhagens apresentadas na Tabela 12. O quimioterápico utilizado como controle foi a doxorrubicina.
Tabela 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade antiproliferativa
Código Tipo de célula tumoral
K-562 Leucemia linfóide
UACC-62 Melanoma NCI-460 Pulmão tipo não pequenas células
MCF-7 Mama NCI-ADR Mama que expressa o fenótipo de
resistência MDR
HT-29 Cólon OVCAR-3 Ovário
786-0 Rim PCO-3 Próstata
3.4 – Dados espectroscópicos das substâncias isoladas 3.4.1 – Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol Fórmula molecular: C30H50O IV νKBr cm-1, (FIGURA 3) max 3324 (O-H), 2917 – 2849 (C-H), 1472 – 1462 (CH2).
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 4)
[M.+ ] 426 (14,4); 411 (8,3); 281 (9,9); 219 (11,5); 218 (24,4); 208 (18,1); 207 (52,5); 203 (21,6); 191 (21,8); 190 (20,6); 189 (43,2); 176 (7,8); 175 (18,0); 173 (10,9); 163 (16,1); 162 (10,0); 161 (19,4); 149 (21,3); 148 (16,9); 147 (27,3); 145 (9,6); 137 (13,2); 136 (21,9); 135 (45,4); 134 (16,7); 133 (24,6); 123 (33,4); 122 ( 21,8); 121 (47,5); 119 (32,3); 109 ( 58,9); 108 (36,0); 107 ( 55,0); 105 (31,3); 97 (16,4); 96 (18,5); 95 (78,1); 93 (62,0); 91 (29,8); 83 (23,8); 81 (79,4); 79 (44,6); 71 (24,4); 69 (73,7); 68 ( 29,7); 67 (55,1); 57 ( 32,4); 55 (87,6); 53 (16,6); 43 ( 100,0); 41 (81,5); 40 (47,2); 39 (11,0).
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 5)
4,69 (H-29; d;zsHz 2,4; 1H); 4,56 (H-29; m; 1H); 3,19 (H-3; dd;zsHz 10,8 e 5,4; 1H); 2,39 (H-19; spt; 1H); 1,91 (H-21; m; 1H); 1,88 (H-15; t;2,4; 1H); 1,68 (H-30; s; 3H); 1,66 (H-13; t; 3,0; 1H); 1,65 (H-1; 1H); 1,62 (H-12; 1H); 1,54 (H- 2; 2H); 1,49 (H-16; 2H); 1,41 (H-7; 2H); 1,41 (H-22; 1H); 1,38 (H-11; d; 1,5; 1H); 1,36 (H-18; 1H); 1,35 (H-21; m; 1H); 1,28 (H-9; 1H); 1,20 (H-11; 1H); 1,20 (H-22; m; 1H); 1,07 (H-12; 1H); 1,03 (H-26;s; 3H); 0,99 (H-15; d; 2,1; 1H);0,97 (H-23; s; 3H); 0,94 (H-27; s; 3H); 0,88 (H-1; 1H); 0,83 (H-25; s; 3H); 0,79 (H-28; s; 3H); 0,76 (H-24; s; 3H); 0,70 (H-5; 1H).
RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 7) 38,6 (C-1, CH2); 27,3 (C-2, CH2); 79,0 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH); 18,2 (C-6, CH2); 34,1 (C-7, CH2); 40,7 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C); 20,8 (C-11, CH2); 25,0 (C-12, CH2); 37,9 (C-13, CH); 42,7 (C-14, C); 27,3 (C-15, CH2); 35,5 (C-16, CH2); 42,9 (C-17, C); 48,2 (C-18, CH); 47,9 (C-19, CH); 151,1 (C-20, C); 29,7 (C-21, CH2); 39,9 (C-22, CH2); 27,8 (C-23, CH3); 15,2 (C-24, CH3); 16,0 (C-25, CH3); 15,8 (C-26, CH3); 14,4 (C-27, CH3); 17,8 (C-28, CH3); 109,3 (C- 29, CH2); 19,2 (C-30 CH3).
3.4.2 – Substância LC-2: Mistura dos compostos:
LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol
LC-2(II)24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(I) (FIGURA 10)
[M.+ ] 400 (28,2); 367 (19,0); 207 (41,6); 145 (42,2); 133 (22,0); 119 (20,3); 107
(29,7); 105 (26,2); 95 (28,5); 93 (25,9); 91 (28,6); 81 (35,4); 79 (25,8); 73 (23,3); 71 (29,1); 69 (31,9); 67 (28,6); 57 (44,6); 55 (60,7); 43 (100,0); 41 (56,9); 40 (45,0). EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(II) (FIGURA 11)
[M.+ ] 412 (23,7); 281 (27,0); 255 (23,0); 207 (50,0); 159 (21,7); 145 (21,8); 133
(30,1); 119 (19,8); 109 (21,8); 107 (25,2); 105 (25,7); 97 (29,4); 95 (28,8); 93 (27,5); 91 (28,1); 83 (52,1); 81 (47,9); 79 (30,5); 73 (23,9); 71 (20,6); 69 (57,5); 67 (32,7); 57 (28,8); 55 (100,0); 43 (69,0); 41 (63,8).
EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(III) (FIGURA 12)
[M.+ ] 414 (23,6); 213 (16,7); 145 (21,0); 133 (15,7); 119 (18,0); 107 (28,9); 105 (25,6); 95 (30,1); 93 (24,3); 91 (24,8); 85 (16,1); 81 (33,7); 79 (24,7); 71 (22,8); 69 (31,8); 67 (25,7); 57 (52,2); 55 (58,7); 43 (100,0); 41 (48,9).
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), Mistura LC-2 (FIGURA
13)
0,68 (H-18, 3H, LC-2 (I) e (III)); 0,69 (H-18, 3H, LC-2 (II)); 1,01 (H-19, 3H, LC-2 (I) e (III)); 1,03 (H-19, 3H, LC-2 (II)); 0,91 (H-21, 3H, d, 6,3, LC-2 (I) e (III)); 1,03 (H- 21, 3H, LC-2 (II)); 0,85 (H-26, 3H, LC-2 (I) e (II)); 0,83 (H-26, 3H, LC-2 (III)); 0,80 (H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,79 (H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (II)); 0,83 (H-27, 3H, d, 6,3, LC-2 (III)); 0,77 (H-28, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,80 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (II)); 0,85 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (III)).
RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), Mistura LC-2 (FIGURA 14)
37,18(C-1, CH2); 31,58(C-2, CH2); 71,79(C-3, CH); 42,25(C-4, CH2); 140,88(C-5,
C); 121,80(C-6, CH); 31,82(C-7, CH2); 31,82(C-8, CH); 50,08(C-9, CH); 36,43(C-
10, C); 20,97(C-11, CH2); 39,70(C-12, CH2); 42,25(C-13, C); 56,72(C-14, CH);
24,20(C-15, CH2); 28,15(C-16, CH2); 56,01(C-17, CH); 11,84(C-18, CH3); 19,28(C-
19, CH3); 40,20(C-20, CH); 18,92(C-21, CH3, LC-2(I) e(III)); 21,11(C-21, CH3, LC-
2(II)); 33,85(C-22, CH2, LC-2(I) e (III)); 138,42(C-22, CH, LC-2(II)); 39,70(C-23,
CH2, LC-2(I)); 129,36(C-23, CH, LC-2(II)); 28,81(C-23, CH2, LC-2(III)); 45,77(C-24,
CH, LC-2(I)); 51,19(C-24, CH, LC-2(II)); 56,01(C-24, CH, LC-2(III)); 26,00(C-25, CH, LC-2(I)); 31,82(C-25, CH, LC-2(II)); 29,06(C-25, CH, LC-2(III)); 18,66(C-26, CH3, LC-2(I) e (III)); 19,22(C-26, CH3, LC-2(II)); 19,70(C-27, CH3, LC-2(I) e (III));
19,22(C-27, CH3, LC-2(II)); 22,95(C-28, CH3, LC-2(I)); 25,30(C-28, CH2, LC-2(II));
18,66(C-28, CH2, LC-2(III)); 11,72(C-29, CH3, LC-2(I)); 12,12(C-29, CH3, LC-2(II)).
3.4.3 – Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene Fórmula molecular: C30H50O2
IV νKBr cm-1, (FIGURA 15) max
3407 e 3076 (O-H), 2942 – 2869 (C-H), 1455 (CH2), 1375 (CH3), 1106 – 1033 (=C-
H).
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 16)
[M.+ ] 456 (7,2); 411 (12,5); 248 (31,0); 234 (19,6); 220 (18,3); 207 (100,0); 203 (24,1); 190 (9,6); 189 (42,8); 175 (18,1); 147 (17,3); 137 (13,2); 135 (47,4); 123 (35,4); 122 ( 24,8); 119 (33,3); 109 ( 58,9); 107 ( 54,0); 95 (78,6); 83 (23,2); 81 (80,2); 79 (43,5); 69 (72,8); 68 ( 31,1); 57 ( 31,8); 55 (89,3); 53 (17,3); 40 (56,2); 39 (7,0).
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 17)
4,68 (H-29;zsHz 1H); 4,58 (H-29; 1H); 3,78 (H-28; dd; 10,2; 1H); 3,31 (H-28; dd; 10,8; 1H); 3,18 (H- 3; dd;zsHz 10,8 e 5,1; 1H); 2,38 (H-19; m; 1H); 1,95 (H-21; m; 1H); 1,92 (H-16; 1H); 1,84 (H- 22; 1H); 1,68 (H-30; s; 3H); 1,68 (H-15; 1H); 1,64 (H-1; 1H); 1,63 (H-12; 1H); 1,62 (H-13; 1H); 1,58 (H-2; 2H); 1,57 (H-18; 1H); 1,42 (H-11; m; 1H); 1,39 (H-7; 2H); 1,26 (H-9; 1H); 1,20 (H-16; d; 2,4; 1H); 1,18 (H-11; d; 4,2; 1H); 1,05 (H-12; 1H); 1,04 (H-15; d; 2,7; 1H); 1,02 (H-22; 1H); 1,02 (H-26; s; 3H); 0,98 (H-27; s; 3H); 0,97 (H-23; s; 3H); 0,89 (H-1; 1H); 0,82 (H-25; s; 3H); 0,76 (H-24; s; 3H); 0,67 (H- 5; 1H). RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 19) 38,6 (C-1, CH2); 27,2 (C-2, CH2); 78,9 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH); 18,1 (C-6, CH2); 34,1 (C-7, CH2); 40,8 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C); 20,7 (C-11, CH2); 25,0 (C-12, CH2); 37,2 (C-13, CH); 42,6 (C-14, C); 26,9 (C-15, CH2); 26,9 (C-16, CH2); 47,7 (C-17, C); 48,6 (C-18, CH); 47,7 (C-19, CH); 150,6 (C-20, C); 29,6 (C-21, CH2); 39,8 (C-22, CH2); 27,8 (C-23, CH3); 15,2 (C-24, CH3); 15,9 (C-25, CH3); 15,8 (C-26, CH3); 14,6 (C-27, CH3); 60,5 (C-28, CH2); 109,7 (C- 29, CH2); 18,9 (C-30 CH3).
3.4.4 – Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol Fórmula molecular: C35H60O6
RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 21)
5,35 (H-6; d;zsHz 1H); 5,07 (H-1’; d ; 7,8; 1H); 4,56 (H-3’; dl; 9,3; 1H); 4,45 - 4,25 (H-6’b, H-4’, H-2’; m; 3H); 4,09 - 3,91 (H-6’a, H-5’, H-3α; m; 3H); 0,92 (H-19; s; 3H); 0,64 (H-18; s; 3H). RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 22 ) 37,3 (C-1, CH2); 30,0 (C-2, CH2); 78,4 (C-3, CH); 39,1 (C-4, CH2); 140,9 (C-5, C); 121,8 (C-6, CH); 31,9 (C-7, CH2); 31,8 (C-8, CH); 50,1 (C-9, CH); 36,7 (C-10, C); 21,0 (C-11, CH2); 39,7 (C-12, CH2); 42,3 (C-13, C); 56,6 (C-14, CH); 24,3 (C-15, CH2); 28,3 (C-16, CH2); 56,0 (C-17, CH); 11,7 (C-18, CH3); 19,2 (C-19, CH3); 36,2 (C-20, CH); 18,9 (C-21, CH3); 34,0 (C-22, CH2); 26,1 (C-23, CH2); 45,8 (C-24, CH); 29,2 (C-25, CH); 18,7 (C-26, CH3); 19,7 (C-27, CH3); 23,1 (C-28, CH2); 11,9 (C-29, CH3); 102,5 (C-1' CH); 75,2 (C-2’, CH); 77,9 (C-3’, CH); 71,5 (C-4’, CH); 78,3 (C-5’, CH); 62,6 (C-6’, CH2). 3.4.5 – Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran- 3,5,7-triol. Fórmula molecular: C15H14O6 IV νKBr cm-1, (FIGURA 23) max 3324 (O-H), 1628 (C = C), 1148 (C-O)
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 24)
[M.+ ] 290 (14,0); 272 (44,2); 258 ( 17,0); 164 ( 45,3); 152 (36,4); 139 (100,0); 123 (45,4); 110 (6,6); 64 (13,6); 44 (17,6);39 (6,7).
RMN 1H (CD3OD, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 25)
6,96 (H-2’; d;zsHz
1,8; 1H); 6,80 (H-6’; dd; 1,8; 1H); 6,76 (H-5’; d; 1H); 5,91 (H-6; d; 2,1; 1H); 5,93 (H-8; d; 2,4; 1H); 4,80 (H-2; m;zsHz
1H); 4,17 (H-3; m; 1H); 2,69 (H-4b; dd; 16,8 e 3,0; 1H); 2,87 (H-4a; dd; 16,8 e 4,5; 1H).
RMN 13C (CD3OD, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURAS 26)
79,9 (C-2, CH); 67,5 (C-3, CH); 29,2 (C-4a e C-4b, CH2); 157,8 (C-5, C); 96,4 (C-6, CH); 158,2 (C-7, C); 95,9 (C-8, CH); 157,5 (C-9, C); 100,1 (C-10, C); 132,2 (C-1’, C); 115,4 (C-2’, CH); 145,9 (C-3’, C); 146,1 (C-4’, C); 116,0 (C-5’, CH); 119,5 (C-6’, CH). 3.4.6 – Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-bis-β-D-glicosídeo-3’,5’- dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo). Fórmula molecular:
EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 27)
135 (36,5); 76 (19,2); 75 (100,0); 73 (82,7); 69 (12,2); 60 (84m0); 57 (36,1); 45 (48,2); 44 (47,2); 43 (55,5); 42 (18,0); 41 (11,4).
RMN 1H (D2O, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 28)
6,82 (H-2 e H-6; s;zsHz
2H); 4,90 (H-7; d; 5,1; 1H); 3,32 (H-8, m; 1H); 4,34 (H-9; m; 1Hb); 3,99 (H-9; dd;
dd; 12,0 e 6,0; 1Hb); 3,73 (H-5’; dd; 12,6 e 5,4; 1Ha); 3,57 (H-2’; d; 1,8; 1H); 3,54 (H-4’; 1H); 3,36 (H-3’; d; 1H). RMN 13C (D2O, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 29) 141,1 (C-1; C); 106,9 (C-2 e C-6; CH); 155,9 (C-3 e C-5; C); 136,0 (C-4; C); 88,7 (C-7; CH); 56,2 (C-8; CH); 74,7 (C-9; CH2); 72,3 (C-10; CH); 103,1 (C-11; C); 59,2 (2x OCH3); 105,9 ( C-1’; CH); 79,3 (C-4’; CH); 78,7 (C-3’; CH); 76,4 (C-2’; CH); 63,5 (C-5’; CH2). 3.4.7 – Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4- hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona Fórmula molecular: C21H20O10 IV νKBr cm-1, (FIGURA 35) max
3381 e 3237 (O-H), 1652 (C=O), 1614 (C = C), 1189 (C -O) EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 36)
[M.+ ] 432 (0,6); 414 (12,1); 378 (6,7); 342 ( 6,0); 324 (5,9); 323 (5,7); 312 (6,3); 310 (6,6); 294 ( 8,3); 284 ( 19,7); 283 (100,0); 270 (18,0); 254 (7,7); 165 (37,6); 123 (7,6); 121 (13,4); 119 (7,1); 118 (12,6); 93 (7,7); 89 (7,8); 69 (24,9); 65 (8,9); 63 (8,6); 61 (12,3); 60 (11,8); 55 (17,3); 53 (10,4); 51 (8,5); 44 (14,7); 43 (33,2); 42 (12,1); 39 (13,9).
RMN 1H (DMSO, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 37)
8,02 (H-2’e H-6’; d;zsHz
8,4; 2H); 6,89 (H-3’ e H-5’; d; 8,4; 2H); 6,77 (H-3, s; 1H); 6,26 (H-6; s; 1H); 4,69 (H-1”; d; 9,9; 1H); 3,78 (H-2”; nd; 1H).
RMN 13C (DMSO, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 38) 164,5 (C-2, C); 102,8 (C-3, CH); 182,6 (C-4, C); 160,9 (C-5, C); 98,5 (C-6, CH); 163,0 (C-7, C); 104,4 (C-8, C); 156,5 (C-9, C); 105,0 (C-10, C); 122,0 (C-1’, C); 129,4 (C-2’, CH) 116,3 (C-3’, CH); 161,6 (C-4’, C); 116,3 (C-5’, CH); 129,4 (C-6’, CH); 73,7 (C-1”, CH); 71,2 (C-2”, CH); 78,9 (C-3”, CH); 70,8 (C-4”, CH); 82,1 (C-5”, CH); 61,6 (C-6”, CH2). 4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 – Método de extração e isolamento dos constituintes químicos de L. candicans
O estudo químico de L. candicans iniciou-se com a preparação do extrato bruto metanólico dos galhos e folhas (em separado) por remaceração à temperatura ambiente. Pelo fato dessa espécie ser muito rica em taninos, optou- se por submeter o extrato bruto dos galhos a um pré – fracionamento em coluna de silica gel obtendo-se oito frações, denominadas de LCG-1, LCG-2, LCG-3, LCG-4, LCG-5, LCG-6, LCG-7 e LCG-8 (frações Hexano, Hex./CHCl3 50% ,
Hex./CHCl3 75%, CHCl3, CHCl3/MeOH 25%, CHCl3/MeOH 50%, CHCl3/MeOH
75%, MeOH, respectivamente).
A fração LCG-4 foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 15 frações, sendo que dessas frações foram isolados três substâncias denominadas LC-1, LC-2 e LC-3.
A fração LCG-5 também foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 15 frações, tendo sido isolada a substância denominada LC-4.
Da fração LCG-6 foi isolada a substância LC-5, através de CC em sílica gel e da fração LCG-7 após CC em sílica gel foi isolada a substância LC-6.
O extrato bruto das folhas também foi submetido a um pré – fracionamento em coluna de sílica gel obtendo-se quatro frações denominadas de LCF-1, LCF-2, LCF-3 e LCF-4 (frações Hexano, AcOEt, CHCl3 e MeOH, respectivamente).
A fração LCF-2 foi submetida a uma CC em sílica gel, obtendo-se 8 frações(LCF-1 a LCF-8), sendo que dessas frações foram isolados mais quantidade das substâncias LC-1 e LC-2 e detectado a presença de LC-3. As frações LCF2-6 e LCF-2.7 por serem semelhantes foram reunidas e submetidas a uma CC em sílica gel, obtendo-se 5 novas frações. Esta fração foi denominada LCF-2.6. A fração LCF-2.6.3, por apresentar fluorescência sob luz ultravioleta no comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma CC em silica gel, obtendo- se 4 frações (LCF-2.6.a a LCF-2.6.d). A fração LCF-2.6.3b, por apresentar perfil cromatográfico menos complexo foi submetida a uma cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP). Foram retirados quatro faixas sendo que apenas uma apresentou quantidade suficiente para análises espectroscópicas, a qual foi denominada LCF-2.6b (4,0mg). Os dados de RMN de 1H e de 13C de LCF-2.6b
demonstraram que a substância estava impura, sendo que no processo de purificação não houve quantidade de massa suficiente para continuação dos estudos.
A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol houve a formação de um precipitado de coloração amarela, o qual foi denominado de LC-7.
As demais frações não foram estudas ou por apresentarem pouca massa ou devido à presença de taninos que dificultam muito o trabalho.
4.2 – Determinação estrutural dos compostos isolados
4.2.1 – Substância LC-1
A substância LC-1(35) (16,0mg) foi isolada da fração clorofórmica através de coluna cromatográfica, como um sólido branco solúvel em clorofórmio.
(35)
O espectro no IV (Figura 3) apresentou banda de absorção em 3330 cm
–1 referente a estiramento de ligação OH, em 2917 a 2849 cm –1 referente a
deformação axial de ligação C-H, e deformação angular de grupos metilenos em 1472 a 1462 cm –1. 29 24 23 HO 26 27 28 25 3 11 5 7 15 13 30 21 22 18 17 1 9 20 19
FIGURA 3 – Espectro no IV de LC-1
O espectro de massas de baixa resolução, obtido por inserção direta via sólido (Figura 4), apresentou o pico base em m/e 43, relativo a uma clivagem da cadeia lateral α ao anel com rearranjo e ganho de um hidrogênio (Silverstein e col.,1994), e o pico do íon molecular em m/e 426 [M.+]. Verifica-se ainda os picos
em m/e 218[M.+] - [C
14H23O]+, correspondendo a uma possível clivagem nos
carbonos C-8/C-14 e C-9/C-11(Esquema 3), e ainda um pico em m/e 191[207 – OH/ + H]+ com transferência de um hidrogênio através de rearranjo (Branco &
FIGURA 4 – Espectro de massas (70 eV) de LC-1 m/e 207 m/e 218 HO m/e 426 HO H H H HO HO