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3 MATERIAL E MÉTODOS

3.3 Gastroscopia

Um cronograma de endoscopias foi desenvolvido, para que os exames ocorressem em datas próximas à idade real do potro, com pequenos ajustes, de forma que as endoscopias ocorriam sempre às terças ou quintas-feiras. Os exames, em cada potro, foram iniciados, em média, aos 158 dias (cinco meses e uma semana), com uma variação de dois a quatro dias, visando facilitar o transporte e o manejo dos animais, ao longo do experimento, como demonstrado na Fig. 1.

Os potros foram transportados uma hora antes da endoscopia, do 3º Esq para a Escola de Veterinária da UFMG, onde eram pesados, anotados os seus estados físicos, aberta uma ficha de avaliação gastroscópica individual e conduzidos à Clínica de Eqüinos, Setor de Videoendoscopia. Ao término do exame, retornavam ao Esquadrão.

Após a conclusão da última endoscopia, os potros foram levados à Fazenda do CEDAF. Dessa forma, havia constantemente uma população variável (entre quatro e sete potros e algumas é g u a s ) , e n t r a n d o o u s a i n d o d a c o m p o s i ç ã o d o l o t e .

Figura 1: Fluxograma do experimento.

*Sangue: hemograma, dosagens séricas de gastrina e perfil imunológico. **Amostras gástricas: teste de urease e histologia.

Dia 1: 14 dias antes do desmame; Dia 14: dia do desmame; Dia 15: um dia após o desmame; Dia 17: dois dias após o desmame; Dia 29: 14 dias após o desmame.

Foram realizadas três sessões de endoscopia em cada animal (Fig. 1). Foi utilizada uma sedação leve (Detomidina8, 10 μg/kg, IV). Antes da aplicação do sedativo, era colocado algodão nos ouvidos dos potros, e estes, deixados em baia escura para se tranqüilizarem.

O preparo para a endoscopia constou de um jejum de sólidos de 24 horas e hídrico de 12 horas, com uso de focinheira, para evitar a amamentação e/ou alimentação.

O exame gastroscópico foi realizado com endoscópio9 de 165 cm de comprimento, com um diâmetro externo

8

Dormossedan, Pfizer, Finlândia.

9

Colonoscópio, Olympus, CF tipo EL/I, 165cm de comprimento, 13,5mm de diâmetro externo e 3,2mm de diâmetro interno, Japão.

de 13,5mm, acoplado a um sugador, um insuflador e fonte de luz10.

Ao fibroscópio adaptou-se uma câmara para capturar as imagens, que eram transmitidas a um sistema de vídeo, sendo todos os exames documentados e as imagens posteriormente digitalizadas.

O endoscópio lubrificado11 foi inserido pelo turbinado nasal, sendo sua ponta direcionada dorsalmente para a aritenóide e cuidadosamente introduzida. Com o reflexo de deglutição, o aparelho foi conduzido para a região proximal do esfíncter criocofaringeano, alcançando a porção distal do esôfago. Após a sua entrada no estômago, obteve-se uma visão geral do

10

Fonte de luz, LS 277, Micronal, São Paulo, Brasil.

11

Xilocaína gel, Astra Zeneca, Brasil.

1 14 15 17 29

1ª endoscopia 2ª endoscopia 3ª endoscopia

Desmame M ateri al col etad o Sangue* Amostras gástricas** Sangue Amostras gástricas Sangue Amostras gástricas San gue San gue

órgão, quando então se procedeu à sua insuflação, até que as regiões aglandulares e glandulares da superfície gástrica passavam a ser observadas. Procedia-se então à progressão do endoscópio pela curvatura maior do estômago até o antro pilórico. A partir desse ponto, as contrações normais do estômago foram geralmente suficientes para a sua chegada até o interior do duodeno. Após o exame do duodeno, o aparelho era tracionado para trás até o antro pilórico, quando se procedia a sua retroflexão para a observação da cárdia, da curvatura menor e do fundo. A sucção do ar era realizada após o término do exame, a fim de se evitarem cólicas subseqüentes ou ruptura gástrica. Entretanto, o exame do duodeno foi realizado em apenas três animais, devido ao comprimento insuficiente do endoscópio.

Após o exame, o aparelho era devidamente lavado com água e sabão siliconizado12 externa e internamente, com a realização de aspirações de água, até a remoção completa do sabão. Todas as observações foram anotadas em ficha própria e posteriormente classificadas de zero a quatro, de acordo com a severidade da lesão, como proposto por Andrews et al. (1999), em:

° 0 (zero): o epitélio intacto, sem hiperemia ou hiperqueratose; ° 1: a mucosa intacta, porém

com áreas de hiperemia ou hiperqueratose (na mucosa escamosa);

° 2: lesões pequenas, unitárias ou multifocais;

12

Sabão siliconizado, Íris D´Água, Belo Horizonte, Brasil.

° 3: lesão única, grande ou lesões multifocais;

° 4: lesões extensas com áreas de aparente ulceração profunda.

3.3.1 Colheita dos fragmentos de estômago

Para a colheita das amostras gástricas, utilizou-se uma pinça tipo “boca de jacaré”13, introduzida pelo canal de biópsias do endoscópio.

Foram realizadas biópsias colhidas na mucosa escamosa (margo plicatus), do corpo e fundo gástrico e da mucosa glandular pilórica (antro) e no duodeno, além de biópsias de mucosa com anormalidade endoscópica de acordo com técnica descrita por Collier e Stoneham (1997) e Sherman (1994), sendo dois fragmentos para cada porção. As amostras foram estendidas sobre papel filtro, antes de serem colocadas em formalina tamponada a 10%, e devidamente identificadas. Após 24 horas, as amostras eram transferidas para álcool 70º, para posterior processamento.

O processamento histológico consistiu de técnica rotineira de inclusão em parafina. Foram feitas diversas colorações, sendo a de hematoxilina- eosina em todos os cortes histológicos. Ainda, foram realizadas colorações preliminares pelo Alcian Blue (pH 2,5) (AB pH2,5) em 3% das biópsias e pelo Periodic Acid Shiff (PAS), em 30% das biópsias, selecionadas aleatoriamente (Prophet et al., s/d). Após essa análise inicial, optou-se pelo uso da técnica conjunta de ambas as colorações (PAS-

13

Pinça Wilson-Cook, tipo alligator, CBF – 2,5-230-s, Brasil.

AB pH 2,5), feita em todos os cortes histológicos, conforme proposto por Mowry (1956), citado por Michalany (1980). A finalidade do método está na coloração prévia das mucinas ácidas pelo alcian blue, deixando para o PAS somente as mucinas neutras, o que permite uma rápida diferenciação no exame histológico corrente (Michalany, 1980).

A classificação das lesões obedeceu às recomendações da tabela visual analógica proposta para a classificação das gastrites humanas (Dixon et al., 1996), levando em consideração a atividade, inflamação, atrofia e metaplasia. Cada parâmetro recebeu um escore de 0 a 3 (ausente, discreto, moderado, severo), podendo atingir um total de 12 pontos.

Criou-se uma classificação de uma a quatro cruzes para quantificar a intensidade da preservação do muco, nas colorações por PAS ou AB.

Também foi utilizado o método modificado de coloração por carbol- fuccina, descrito por Rocha et al. (1989) e o de coloração pela prata (Warthin Starry), descrito por Michalany (1980) em todas as biópsias, além da coloração de Giemsa, em sete cortes apenas, (ver em anexos), recomendadas para a identificação de H. pylori.

Realizaram-se microfotografias mediante captura assistida por computador em microscópio de luz14. As imagens, vistas em um monitor de computador, foram obtidas

14

Axiolab light microscope fitted with a 10x objective, Carl Zeiss, Alemanha.

digitalmente, mediante programa próprio15.

3.3.2 Teste de urease em agar gel

O teste de urease foi realizado segundo o protocolo descrito por Collier e Stoneham (1997). Foi utilizado kit comercial em gel16, que permite uma leitura rápida da atividade da urease de uma biópsia. Foram feitos dois testes por animal/endoscopia, com fragmentos do antro e da margo plicato.

As leituras foram realizadas a intervalos de 2 horas por 24 horas e, depois, a cada 12h, até 96h, e classificadas em positivas (viragem do teste) ou negativas.

3.4 EXAMES LABORATORIAIS

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