Imunohistoquímica

O método IHQ, sobretudo após o desenvolvimento de técnicas de recuperação antigénica e de anticorpos que reconhecem especificamente epítopos que não se degradam durante o processamento histológico, foi gradualmente substituindo o método bioquímico DCC (Harvey

et al., 1999; Leake, 2000).

Atualmente, a técnica de IHQ caracteriza-se por, após o corte, desparafinização e re-hidratação das amostras de tecido tumoral, proceder-se à recuperação antigénica, normalmente, através de alta temperatura, de modo a recuperar a estrutura proteica normal, alterada pelo formol durante a fixação. Posteriormente, aplica-se os reagentes de bloqueio de proteínas e da peroxidase endógena, para reduzir as ligações e marcações não específicas, e realiza-se a incubação com os anticorpos primários, dirigidos contra o antigénio que se quer detetar. Mais tarde, incuba-se com os anticorpos secundários, dirigidos contra as imunoglobulinas da espécie animal em que foram produzidos os anticorpos primários, marcados com a substância que permite a visualização do complexo, que geralmente é a horseradish peroxidase (HRP; obtida a partir da raiz do rábano Armoracia rusticana). A HRP oxida o cromogénio ao reagir com o peróxido de hidrogénio. O cromogénio é uma substância que na sua forma oxidada é colorida, estável e

precipita, promovendo cor no local de reação, sendo que o mais utilizado em IHQ é o 3,3’-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB). Este cromogénio quando incubado com a

amostra neoplásica, após a respetiva incubação com o anticorpo secundário, é oxidado pela HRP e origina um precipitado castanho insolúvel em álcool e noutros solventes orgânicos. Por fim, realiza-se a coloração dos tecidos, normalmente, com hematoxilina de Mayer, e interpreta-se os resultados com o auxílio de um microscópio ótico. Há um outro método IHQ, designado de direto, que utiliza apenas anticorpos primários com marcadores acoplados, mas apesar de ser mais rápido e simples, revela pouca ampliação de sinal, menor sensibilidade e maior custo relativo (Ferro, 2013).

Existem dois tipos de anticorpos utilizados em IHQ: monoclonais e policlonais. Os monoclonais derivam de um único clone de plasmócitos imortalizados, e, portanto, são uniformes em estrutura, especificidade e afinidade, podendo ser produzidos por tempo indefinido (Galfrè & Milstein, 1981; Cole, Campling, Atlaw, Kozbor & Roder, 1984; Siegel, 2002; Ferro, 2013). As suas principais vantagens são: o facto de realmente apresentarem elevada especificidade e afinidade, ligarem-se a um só epítopo do antigénio alvo, revelarem alta homogeneidade, ausência de anticorpos inespecíficos, maior facilidade de caracterização e baixa variabilidade de lote para lote. As suas desvantagens são: o seu elevado custo relativo, a dificuldade de obtenção em grandes quantidades, a incapacidade de identificar epítopos que estejam destruídos, mesmo na presença do antigénio alvo, e a possibilidade de outros antigénios

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apresentarem o epítopo selecionado (a grande vantagem da elevada especificidade pode, assim, tornar-se inútil) (Ferro, 2013). Os anticorpos policlonais são produzidos por várias populações de plasmócitos, pelo que reconhecem diversos epítopos do antigénio a ser estudado. As suas vantagens incluem: o seu baixo custo relativo, a capacidade para detetar um antigénio mesmo na ausência de vários dos seus epítopos e a relativa facilidade de obtenção de grandes quantidades. Contudo, apresenta as desvantagens de: relativa baixa especificidade, baixa homogeneidade, reconhecimento de vários epítopos que podem pertencer a diferentes antigénios, possibilidade de presença de anticorpos não específicos (risco de marcação inespecífica), maior dificuldade de caracterização e relativa alta variabilidade de lote para lote (Ferro, 2013).

A relativa facilidade de execução, a ampla disponibilidade de reagentes, a possibilidade de ser realizada em amostras tumorais fixadas em formol e incluídas em parafina (mais facilmente arquivadas), elevada sensibilidade e especificidade, os seus relativos baixos custos, a capacidade de analisar morfologicamente tecidos neoplásicos de reduzidas dimensões e de garantir que apenas as células tumorais são avaliadas (menores riscos de falso-positivos em comparação com o método bioquímico) com recurso a um microscópio de rotina comum, tornaram a técnica de IHQ na escolha universal para determinar a expressão de RE, RP e, mais tarde, de HER-2 nos TM (Greene, Sobel, King & Jensen 1984; Peleteiro, 1994; Leake, 2000; Hammond et al. 2010; Moelans, Weger, Van der Wall & van Diest, 2011; Zaha, 2014). Contudo, os seus resultados apresentam uma variabilidade interobservador, são semi- quantitativos e não indicam se a proteína imunomarcada é funcional ou não (Harvey et al., 1999; Gordts et al., 2000). Além disso, dependem de variáveis interlaboratoriais (Leake, 2000). Neste sentido, a Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO) e o Colégio Americano de Patologistas (CAP) referem que até 20% das avaliações imunohistoquímicas de RE-α, RP e HER-2, em todo o mundo, podem ser imprecisas devido a variações pré-analíticas (p.ex. no método de processamento dos tecidos, tempo e tipo de fixação), analíticas (p.ex. nos equipamentos utilizados, procedimentos laboratoriais, competências profissionais, tipo de recuperação antigénica, reagentes e anticorpos utilizados, controlos internos e externos, métodos laboratoriais automatizados) e/ou pós-analíticas (p.ex. critérios de interpretação dos resultados, elaboração de relatórios e qualidade dos procedimentos) (Wolff et al., 2007; Hammond et al., 2010). Assim, para evitar tais variações, os painéis de especialistas internacionais emitiram uma série de recomendações como linhas orientadoras de padronização, otimização e reprodutibilidade dos procedimentos de avaliação IHQ dos respetivos recetores em cancros de mama humanos, de modo a melhorar a precisão dos

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resultados e a utilidade dos mesmos como marcadores preditivos (Hammond et al., 2010; Wolff

et al., 2013), de entre as quais se destacam:

 Determinação da imunoexpressão dos RH e HER-2 em todos os TM invasivos, bem como nas respetivas recidivas e metástases, sempre que possível;

 Fixação precoce das amostras tumorais excisadas em formol neutro tamponado a 10% (num volume 10 vezes superior ao seu próprio volume), durante 6 a 72 horas;

 Seleção de anticorpos com especificidade e sensibilidade bem estabelecidas e clinicamente validados. Recomendam para os RE-α os monoclonais 1D5, 6F11, SP1, enquanto para os RP referem os monoclonais 1A6, 1294 e 312. Em relação ao HER-2, encontram-se

comercialmente disponíveis os seguintes clones de anticorpos: A0485 (Herceptest®;

policlonal; epitopo alvo intracelular), CB11 (monoclonal; epítopo alvo intracelular), SP3 (monoclonal; epítopo alvo extracelular), TAB250 (monoclonal, epítopo alvo extracelular) e 4D5 (monoclonal, epítopo alvo extracelular) (Moelans et al., 2011);

 Utilização de controlos positivos e negativos em cada ensaio para monitorizar o seu desempenho, assegurar que todos os reagentes são utilizados corretamente e para detetar uma possível perda de sensibilidade. Os controlos positivos podem incluir tecido endometrial ou tumoral, com expressão de recetores conhecida, e elementos epiteliais normais, que convém terem um padrão de marcação heterogéneo, com um número variável de células que exibam fraca, moderada e intensa imunorreatividade. Se o padrão for homogéneo o risco de uma avaliação de resultados falso-negativos é mais elevado em consequência de uma insuficiente sensibilidade de deteção das células com fraca a moderada imunorreatividade. Os controlos negativos normalmente adotados são as células mioepiteliais e as células do estroma, pois estas revelam invariavelmente um resultado negativo. Se os controlos não revelarem a reação esperada, o resultado do teste do paciente não deve ser tido em consideração e o ensaio deve ser repetido com os reagentes de referência, nas condições padrão até que a reatividade normal do material de controlo seja alcançada;

 Interpretação do resultado da análise IHQ dos RE e RP com base na avaliação da percentagem de núcleos das células tumorais com marcação positiva e na intensidade da coloração. O limiar de positividade a adotar deve ser ≥ 1% de núcleos tumorais marcados, na presença de reatividade interna e externa esperada;

 Definição dos resultados da análise da imunoexpressão de HER-2 de acordo com a percentagem de células com marcação membranar, a extensão e a intensidade da marcação. Os mesmos devem ser considerados positivos se a marcação membranar for completa em mais de 10% das células tumorais, uniforme e intensa, na presença de reatividade interna e externa esperada. No caso da marcação membranar ser completa, mas com uniformidade, intensidade

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e/ou numa percentagem de células neoplásicas incertas, deve então repetir-se a análise IHQ ou realizar um teste alternativo, nomeadamente a hibridização fluorescente in situ (FISH);  Implementação de programas de controlo de qualidade internos e externos validados.

Os painéis de especialistas consideraram ainda que os danos causados pelo não tratamento de pacientes com sobreexpressão de RE-α, RP e/ou HER-2, são maiores do que o risco de tratamentos excessivos em alguns pacientes, pelo que na dúvida a terapêutica endócrina e imunológica pode ser realizada (Hammond et al., 2010; Wolff et al., 2013).

3.5.1.3. Análise de perda de heterozigocidade e Hibridização genómica comparativa