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3.1AMOSTRAGEM

Os animais utilizados no presente trabalho foram obtidos em duas etapas. Na primeira etapa, utilizaram-se 20 exemplares de P. argenteus nos seguintes estádios: repouso, maturação e desovado. Os peixes foram capturados no rio São Francisco e mantidos em confinamento na Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias. Para obtenção dos ovários desovados os peixes foram submetidos à desova induzida por hipofisação. Na segunda etapa, fragmentos de ovários de P. argenteus que foram capturados em dois trechos do rio São Francisco (Figura 6): 25 exemplares logo a jusante da barragem de Três Marias (S1) e 20 exemplares na confluência com rio Abaeté (S2). Os fatores físico-químicos da água (pH, temperatura da água, oxgênio dissolvido e condutividade) foram determinados com sonda Horiba modelo W-22XD durante a coleta sempre pela manhã, com amostragem da margem esquerda, centro e margem direita do rio.

O projeto seguiu os princípios éticos de experimentação com animais de acordo com o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG (CETEA protocolo nº: 073/08).

Figura 6: Mapa do rio São Francisco a jusante da UHE de Três Marias (Adaptado de Sato et al., 2005).

Trecho 1

Trecho 2

Trecho 2

3.2HISTOLOGIA

Amostras de ovários fixadas em líquido de Bouin por 6 horas a temperatura ambiente foram incluídas em parafina ou em glicol metacrilato (JB-4 Polysciences). Secções histológicas foram coradas com hematoxilina-eosina, tricrômico de Gomori ou azul de toluidina-borato de sódio. Algumas amostras foram submetidas à técnica histoquímica do PAS e contra-coradas com hematoxilina.

3.3TUNEL

Amostras de ovários fixadas em paraformoldeído 4% em tampão fosfato 0,1M pH 7,3 por 24 horas a 4°C foram incluídas em parafina, seccionados e submetidos à técnica de TUNEL in situ utilizando o Kit TdT FragEL Calbiochem ou Kit Apoptag Millipore para a identificação da fragmentação do DNA das células em apoptose. Para isso, incubaram-se as secções histológicas com mistura da enzima terminal deoxynucleotides transferase (TdT) e deoxinucleotídeos conjugados com biotina em câmara úmida a 37°C por 3 h. Em seguida, aplicou-se solução de estreptavidina conjugada com peroxidase em câmara úmida a temperatura ambiente por 45 min. A reação da peroxidase foi revelada com diaminobenzidina (DAB) durante 2 min à temperatura ambiente. As lâminas foram contra-coradas com hematoxilina. Para controle-negativo, uma das lâminas não recebeu a mistura contendo a enzima TdT e deoxinucleotídeos. Para a permeabilização e inativação de peroxidase endógena foram utilizadas proteinase K e água oxigenada 3% respectivamente. Foram consideradas como células apoptóticas aquelas que apresentaram reação TUNEL-positiva e alterações celulares como retração citoplasmática e/ou fragmentação semelhante a corpo apoptótico.

3.4IMUNOFLUORIMETRIA INDIRETA

Amostras de sangue (1,0 – 5,0 ml) de exemplares com ovários em repouso, maturação e desovado (0, 48 e 96 horas) foram coletadas através de punção da veia caudal. As amostras foram transferidas para tubos de ensaio e mantidas até coagulação para em seguida serem centrifugadas (10-15 min a 800 rpm). Alíquotas do soro foram mantidas a -20ºC e a determinação dos níveis de E2 foi realizada através de imunofluorimetria indireta (kit AutoDELFIA Estradiol – Perkin Elmer).

3.5IMUNOHISTOQUÍMICA

Amostras de ovários fixadas em DMSO/metanol ou paraformaldeído foram incluídas em paraplast (Sigma) e seccionadas e submetidas a imunohistoquímica. Foram utilizados os anticorpos primários descritos na tabela 1.

Utilizou-se pré-tratamento para recuperação antigênica com proteinase K a temperatura ambiente ou pré-tratamento com tampão citrato pH 6,0 a 95°C por 30 min. Após lavagem com PBS, utilizou-se tampão (BSA 2%) para bloqueio de reações inespecíficas e H2O2 3% para bloqueio da peroxidase endógena. As secções foram

incubadas com o anticorpo primário “overnight” a 4°C. Após lavagem com PBS, os cortes foram incubados com anticorpo secundário conjugado com biotina (Kit LSAB- DAKO) e a reação foi revelada com DAB. Para as análises em microscopia confocal (Carl Zeiss LSM 510) os cortes de tecido foram incubados com anticorpo secundário ALEXA 488 anti-coelho (1:200) e ALEXA 568 anti-camundongo (1:200) e para marcação do núcleo das células utilizou-se DAPI (1:500). Para controle negativo, uma das lâminas não recebeu anticorpo primário.

Tabela 1. Anticorpos primários da Santa Cruz Biotechnology utilizados para imunohistoquímica de ovários de P. argenteus.

Antígeno Natureza Diluição

MMP-9 Monoclonal- camundongo 1:10

Colágeno IV Policlonal- coelho 1:100

Laminina β2 Policlonal- coelho 1:50

Fibronectina Policlonal- coelho 1:25

Actina Monoclonal- camundongo 1:100

PCNA Policlonal- camundongo 1:80

Cat-D Policlonal- coelho 1:25

3.6WESTERN-BLOT

Com o objetivo de determinar a especificidade dos anticorpos, uma vez que foram utilizados anticorpos de mamíferos, e avaliar a expressão das proteínas de interesse, 100 mg de amostra do tecido foram lisados com tampão de lise + inibidores de proteases. O homogeneizado foi centrifugado a 120.000 g por 30 min, e o sobrenadante contendo as proteínas foi mantido. As proteínas foram adicionadas em gel de eletroforese a 12% e posteriormente transferidas para membrana de nitrocelulose. Após a transferência, as

reações inespecíficas foram bloqueadas com BSA 1%. A membrana foi incubada por 20 min com os anticorpos primários. Depois de três lavagens com tampão PBST, a membrana foi incubada por mais 10 min com anticorpo secundário conjugado com peroxidase. A reação foi revelada pela adição de 3’3 diaminobenzidina em PBS contendo cloronaftol, metanol e água oxigenada. Todos os testes foram feitos em triplicatas e a densidade das bandas obtidas foi estimada utilizando-se do ImageJ Software.

3.7TESTE COLORIMÉTRICO

Para identificar a atividade enzimática da caspase-3 em ovários foi utilizado o kit de teste colorimétrico para Caspase-3 da R&D Systems. As amostras do tecido foram pesadas e lisadas com 0.5 ml do tampão de lise celular. O homogenizado foi centrifugado por 1 min a 10.000 g. O sobrenadante foi mantido e incubado com substrato colorimétrico da caspase-3 (DEVD-pNA) a 37°C por 2 h. O nível da atividade da caspase-3 foi diretamente proporcional a reação de cor.

3.8 MORFOMETRIA

Foi realizada contagem de células apoptóticas (TUNEL-positivas), área imunomarcada (Software ImagePro-Plus), medida do diâmetro ovocitário e frequência de estruturas ovarianas.

3.9ANÁLISE ESTATÍSTICA

4- RESULTADOS

Os resultados obtidos no presente trabalho foram publicados nos seguintes artigos:

THOMÉ R.G., SANTOS H.B., SATO Y., RIZZO E., BAZZOLI N., 2010. DISTRIBUTION OF LAMININ Β2, COLLAGEN TYPE IV, FIBRONECTIN AND MMP-9 IN OVARIES OF THE TELEOST FISH. JOURNAL OF MOLECULAR HISTOLOGY. 41, 215-224.

THOMÉ R.G., DOMINGOS F.F.T., SANTOS H.B., MARTINELLI P.M., SATO Y., RIZZO E., BAZZOLI N., 2011. APOPTOSIS, CELL PROLIFERATION AND VITELLOGENESIS DURING THE FOLLICULOGENESIS AND FOLLICULAR GROWTH IN TELEOST FISH. TISSUE AND CELL. 44, 54-62.

O R I G I N A L P A P E R

Distribution of laminin b2, collagen type IV, fibronectin

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