MATERIAL E MÉTODOS Amostragem das espécies

Foram coletadas 11 populações do complexo P. ovalis, sendo sete no estado da Bahia, duas no Espírito Santo e duas populações nos estados do Rio de Janeiro e São Paulo, perfazendo um total de 168 indivíduos, dos quais foram coletados dados de marcadores moleculares de ISSR (Tabela 8). Estas populações foram escolhidas por representar uma amostragem significativa da distribuição geográfica do complexo, que apresenta uma distribuição na mata atlântica do Pernambuco à região norte de São Paulo (fig. 5, capítulo 2).

As populações foram coletadas em seu ambiente natural, sendo coletados entre 10 a 20 indivíduos por população, com exceção da população de Parati com apenas dois indivíduos. Foram coletadas folhas jovens e em perfeito estado morfológico, sem presenças de fungos ou indicações de presença de ovos de insetos, para evitar possíveis contaminações nas amostras. O material coletado foi conservado em silica-gel e um

voucher de cada população está depositado no Herbário da Universidade Estadual de

Feira de Santana (HUEFS), acrônimo segundo Holmgren et al. 1990 (Tabela 08).

Este estudo servirá para complementar os estudos realizados no capítulo 2 com dados morfométricos, no intuito de solucionar a problemática do complexo Passiflora

Tabela 08. Populações do complexo Passiflora ovalis classificadas de acordo com Vitta & Bernacci (2004), juntamente com o número de

indivíduos por população, número do voucher depositado no herbário HUEFS e localização de cada população.

Táxon Voucher

HUEFS no.

No. Indiv.

População Localidade Estado Coordenadas

1 Passiflora contracta T.S.Nunes 1405 104175 14 PC_BABelm Belmonte Bahia S1606'22,0 W38o57'42,6

2 Passiflora contracta T.S.Nunes 1348 101433 12 PC_BACam Camaçari Bahia S1240'26 W38o18'4

3 Passiflora contracta T.S.Nunes 1307 101391 16 PC_BACon Conde Bahia S122'2 W37o42'9

4 Passiflora contracta T.S.Nunes 1279 101363 16 PC_BAImb Imbé Bahia S127'40 W37o59'14

5 Passiflora contracta P.D.Carvalho 293 103697 11 PC_BAMar Maraú Bahia S147'50 W38o59'55

6 Passiflora contracta T.S.Nunes 1789 120179 16 PC_BAIlhe Ilhéus Bahia S1447' W39o12'

7 Passiflora contracta S.F.Conceição 451 103828 14 PC_PC_BAUna Una Bahia S1515'16 W39o3'8

8 Passiflora contracta T.S.Nunes 1809 124218 17 PC_ESCBar C.Barra E.Santo S1836'49 W39o47'39

9 Passiflora contracta T.S.Nunes 1762 112404 11 PC_ESLin Linhares E.Santo S196'62 W39o53'33

10 Passiflora ovalis T.S.Nunes 1837 124248 2 PO_RJPar Parati R.Janeiro S2320'68 W44 o49'87

Extração de material

A extração do DNA total foi feita através do método de CTAB 2x (Doyle & Doyle 1987), o material preservado em sílica-gel foi macerado (50mg), com areia lavada e autoclavada e/ou nitrogênio liquído, depois de macerado o material foi diluído em 700µl de CTAB e 4µl de β-mercaptoetanol, aquecido em banho-maria por 20 minutos a temperatura de 60-70ºC, acrescentado de 800µl de clorofórmio e deixado no agitador por 240 minutos. O material foi centrifugado a rotação de 13.000 rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi recolhido com o auxílio de uma pipeta e passado para novos tubos para microcentrífugas numerados. A precipitação foi obtida com a adição de 700µl de isopropanol (2-propanol), deixado em freezer por 24 horas, depois desse período o material foi centrifugado para separação do pellet, e lavado com etanol a 70% por 2 ou 3 vezes, colocado para secar por ca. 24 horas em temperatura ambiente, e ressuspendido com 100µl de tampão TE (10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Após a ressuspensão a concentração de DNA foi determinada por eletroforese conjuntamente com um marcador Lambda Hind III (Invitrogen Corporation).

Amplificação do ISSR

Para a amplificação de loci de ISSR, foram testados 20 primers, disponíveis no Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas da UEFS, sendo que destes apenas sete se apresentaram polimórficos para o grupo em questão (Tabela 09). Foram realizados vários testes de PCR, para aperfeiçoar a melhor condição de reação, incluindo diferentes concentrações de DNA genômico (0,5 – 2µl), concentração de primer (1,0µl), MgCl2 (1,5-1,7µl), dNTP (4,0µl), aditivo BSA – Albumina Bovina Sérica (0,5µl), taq polimerase – Phoneutria (0,1-0,2µl), Tampão 10x (500 mM KCL, 100 mM, tris-HCl pH8,4, 1% triton X-100 – Phoneutria Biotec. Ser. Ltda) e H20 (água ultra-pura). A

temperatura de anelamento variou entre 45º-52º por 45 minutos, num total não variável de 35 ciclos, o produto total de PCR obtido foi de 18µl. Nos testes iniciais os produtos do DNA genômico foram testados diluídos na concentração de 1/10, 1/20, 1/50 e 1/100 sendo que a concentração que apresentou melhores resultados para todos os primers foi o DNA total sem diluição. As amplificações foram obtidas através dos termocicladores Perkin Elmer Gene Amp 9700, Máster Cycle Eppendorf e Px E0,2 Thermo Hybrid. As condições finais de amplificação foram: temperatura inicial de aquecimento: 94ºC por 1:30 minutos; denaturação: 94ºC durante 40 minutos; anelamento 45ºC por 45 minutos;

segundos e 44ºC por 45 segundos em cada ciclo, perfazendo um total de 35 ciclos e com a extensão final de 72ºC por 7 minutos.

Uma vez obtido o melhor protocolo para cada primer, este foi seguido fielmente para todos os indivíduos da população, a fim de evitar a amplificação de bandas não comparáveis e de forma a permitir a repetibilidade dos dados.

Tabela 09. Lista dos primers utilizados, seqüências nucleotídicas e número de bandas

analisadas para o complexo Passiflora ovalis. Os sete primeiros primers foram os selecionadas na análise de variabilidade genética.

Primer Seqüência (5’ – 3’) No. de Bandas

M2 GGG CGA GAG AGA GAG AGA GA 24

MANNY CAC CAC CAC CAC RC 28

GOOFY GTG TGT GTG TGT GTY G- 27

OMAR GAG GAG GAG GAG RC 24

DAT GAG AGA GAG AGA GARG 30

UBC899 CAC ACA CAC ACA RG 16

UBC902 GTG TGT GTG TGT AY 14

JOHN AGA GAG AGA GAG AGY C Não caracterizado

AW3 GTG TGT GTG TGT RG Não caracterizado

TERRY GTG GTG GTG GGT GRC Não caracterizado

BECKY CAC ACA CAC ACA CAYC Não caracterizado

M1 CAA GAG AGA GAG A Não caracterizado

R7 CTC TCT CTC TCT CTC TRG Não caracterizado

UBC844 CTC TCT CTC TCT CTC TCT RC Não caracterizado

UBC898 CAC ACA CAC ACA RY Não caracterizado

UBC901 GTG TGT GTG TGT YR Não caracterizado

UBC814 CTC TCT CTC TCT CTC TTG Não caracterizado UBC843 CTC TCT CTC TCT CTC TRA Não caracterizado CHRYS CAC ACA CAC ACA CAY G Não caracterizado

Análise dos produtos de amplificação através da eletroforese

Após a amplificação, o produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1,8% (120ml de tampão SB 1x, 1,8mg de agarose). O DNA (14µl do produto do PCR) foi corado com o auxílio do corante azul de bromofenol (TAE 10 x 0,5ml; EDTA 0,5 M 0,4 ml; SDS – 10% 0,2ml; azul de bromofenol 0,2ml; glicerol 7,0ml; água estéril 1,7ml) e brometo de etídio (5µl), com o tampão sódio-borato (pH 8,0 e 200 mM de hidróxido de sódio – Brody e Kern 2004). Para quantificar o tamanho dos fragmentos (bandas) foi utilizado um marcador de peso molecular (Ladder 100 pares de bases - pb), a corrida foi feita em cuba de eletroforese, durante três horas, com voltagem de 100V e amperagem de 75mA. As bandas foram visualizadas em transluminador UV (Spectroline) e registradas através da utilização da câmara digital Kodak EDAS 290, através do software Kodak 1D 3.6. As bandas obtidas do marcadores moleculares de ISSR foram escorados como marcadores dialélicos, onde o tamanho do fragmento representa um locus. As bandas com pouca intensidade ou de difícil definição foram excluídas da análise. As imagens dos géis foram salvas no formato .tif (8 bits), e analisadas através do programa GelCompar II, onde uma comparação entre todas as imagens dos géis foi realizada (exemplificado pelo UBC899 na figura 13), e os resultados foram convertidos numa matriz com a presença dos locus dialélicos, através da presença (1) ou ausência (0) das bandas. Os dados faltantes foram tratados como (-1). Esta matriz binária foi utilizada para as análises estatísticas.

Análises estatísticas

Para as análises estatísticas foram utilizados os seguintes programas: GENEALEX (Peakall & Smouse 2006 – http://www.anu.edu.au/BOZO/GenALEx), PAST (Hammer et al. 2001), AFLPSURV (Vekemans 2002), HICKORY versão 1.1 (Holsinger & Lewis 2003-2007), PHYLIP (Felsenstein 1991-2006), PAUP 4.0b10 (Swofford 2008) e POPGENE 1.32 (Yeh et al. 1999 - disponível no sítio ftp://ftp.microsoft.com/Softlib/MSLFILES/HPGL.EXE).

Figura 13. Gel de agarose corado com brometo de etídio, com amplificação do primer

UBC899 em populações do complexo Passiflora ovalis, as bandas 5, 15 e 21 são do marcador de peso molecular Ladder 100 pb.

Uma análise de variabilidade genética para todas as populações foi realizada através dos seguintes parâmetros: número médio de alelos (N), número de alelos exclusivos, percentual de loci polimórfico (P), heterozigosidade média esperada (He),

distância genética e de identidade genética de Nei, calculadas pela distância não enviesada de Nei (1978) (D), proporção da diversidade entre populações (GST),

estruturação genética (FST). Para estas análises foi utilizado o programa GenALEx e

AFLP-SURV. Os cálculos de GST e FST são importantes para avaliar a estrutura

populacional segundo o modelo de ilhas (Takata & Nei 1984). Para estimr o fluxo gênico (Nm) foi utilizado o programa POPGENE. Este fluxo gênico foi corrigido indiretamente através da fórmula Nm = 0,5(1-GST)/GST (McDermott & McDonald, 1993

apud Brandão 2008).

Análises de agrupamentos foram realizadas com a ajuda dos softwares: AFLPSURV, PHYLIP (NEIGHBOR e CONSENSE). Para obter um resultado mais significativo, as análises de agrupamento foram realizadas a partir da matriz de distância genética (calculada pela distância não enviesada de Nei) e pelos valores de FST (obtido

par a par no AFLPSURV). Os dendogramas obtidos foram visualizados através do TreeView 1.6.1 (Page 2000), a partir dos métodos de agrupamentos UPGMA (Sneath & Sokal 1973) e Neighbor-joining (Saitou & Nei 1987). Uma análise de bootstrap foi realizada com 1.000 replicações para avaliar a significância das topologias obtidas,

através dos programas NEIGHBOR e CONSENSE (PHYLIP). Os dendogramas não foram enraizados uma vez que não foram utilizados nesta análise nenhuma população como grupo externo.

Foram feitas matrizes de distância genética e de identidade genética (Nei 1978), Análise de Coordenadas Principais (PCO), e uma Análise de Variância Molecular (AMOVA), a partir das matrizes de distância e de identidade genética, conduzida no sentido de analisar a variação total dentro e entre as populações. Para esta análise foi conduzido um teste de significância com 999 permutações dos dados, em três etapas: 1) Considerando todas as populações como um único grupo; 2) separando as populações das duas espécies em dois grupos; 3) entre as populações de cada espécie para avaliar se existem diferenças significativas entre populações da mesma espécie.

Uma outra análise foi realizada no intuito de verificar a estrutura populacional com a estimativa de parâmetros como FST (Wright 1978) e endogamia (f) nos dados

sobre equilíbrio de Hardy-Weinberg, através do programa HICKORY. Para esta análise foram assumidos quatros modelos: 1) “Full model” que estima o coeficiente de endogamia; 2) “f=0” que calcula todas as estimativas assumindo a ausência de endogamia; 3) “theta=0” que calcula todas as estimativas assumindo a ausência dos parâmetros equivalentes ao FST; 4) “f free model” que não estima o coeficiente de

endogamia diretamente. O theta e os outros parâmetros são estimados a partir do coeficiente de endogamia obtidos da distribuição anterior durante as corridas de MCMC (Markov Chain Monte Carlo). Foram empregadas 50000 cadeias como burn-in, com um número de amostras de 50000 e o fator thinning igual a 5 segundo o default. Para estimar o modelo mais adequado foi utilizado o critério do DIC (Deviance Information

Criterion), Dbar, Dhat e pD, no qual o valor do DIC escolhido é o que minimiza a soma

do Dbar e pD, e ainda seguindo as interpretações dadas pelo manual do programa.

Resultados

Variabilidade Genética

Um total de 163 loci foram obtidos para os sete primers amplificados para as 11 populações. Os tamanhos dos fragmentos obtidos variaram de 100 a 1600 pb (fig. 13) Dos 163 loci obtidos apenas um foi monomórfico. Na análise por população, o grau de polimorfismo variou de 70,37% na população PC_BAIlh e 17,28% na população PO_RJPar. As populações que apresentaram alelos exclusivos foram: PC_BACon,

PC_BACon, PC_BAMar, PC_BAUna e PO_SPUba apresentaram apenas um alelo exclusivo e a população de PO_RJPar apresentou três alelos exclusivos. O número de alelos gerados por primer neste estudo variou entre 6 a 25, com uma média de 15 alelos por primer, sendo o primer DAT o que apresentou o maior número com 30 bandas e o primer UBC902, o menor número com 14 bandas (Tabela 8). Considerando-se a análise por espécie, P. contracta (populações da Bahia e do Espírito Santo) apresentou apenas três alelos exclusivos (total de 102 alelos) e P. ovalis (populações do Rio de Janeiro e São Paulo) quatro (total de 17 alelos), em relação a quantidade de populações amostradas e o número de indivíduos por populações, a quantidade de alelos exclusivos foi maior na população PO_RJPar de P. ovalis (três alelos exclusivos) (Tabela 10).

A análise de variabilidade genética entre as populações de P. ovalis e P.

contracta apresentou variações entre populações de: 37% (P. ovalis) e 13% (P. contracta), sendo a variação dentro das populações de 63% (P. ovalis) e 87% (P. contracta). A variação encontrada na análise utilizando-se todas as populações sem

especificação das espécies foi 19% entre populações e 81% dentro das populações (Tabela 11).

Diversidade Genética

O maior valor de heterozigosidade média esperada (He) foi de 0,188 (BAImbé) e

o menor valor foi de 0,072. Entre as espécies o maior valor encontrado para P.

contracta foi de 0,188 (PC_BAImb) e o menor valor foi de 0,141 (PC_ESLin), em P. ovalis o maior valor encontrado foi de 0,167 (PO_SPUba) e o menor valor foi

encontrado foi de 0,072 (PO_RJPar) (Tabela 10). A diversidade genética total (HT) entre

todas as populações foi de 0,2375 comparada com a diversidade genética dentro das populações (HS) de 0,1972 (Tabela 11).

Estruturação Genética

As Análises Moleculares de Variância (AMOVA), realizadas com todas as onze populações apresentaram uma variação entre as espécies de 28%, dentro das populações de 62% e entre as populações por espécies de 10% (Tabela 12). A estruturação genética entre as populações do complexo P. ovalis analisadas foi de 0,2700 (GST), enquanto que

o fluxo gênico (Nm) estimado a partir desta estruturação foi de 1,3519. Em uma segunda análise, realizada por espécie, somente com as populações de P. contracta a variação encontrada dentro das populações foi de 87% e entre as populações foi de

13%. Uma análise realizada com as duas populações de P. ovalis a variação encontrada dentro das populações foi de 63% e entre as populações de 37% (Tabela 11). Nesta análise o valor da estruturação genética (GST) foi de 0,1308, e o fluxo gênico (Nm) foi

de 3,3240, confirmando o fluxo gênico alto intrapopulacional para ambas as espécies. Na terceira análise para as populações de P. ovalis a variação encontrada dentro das populações foi de 63% e entre as populações foi de 37%. Nesta análise o valor da estruturação genética (GST) foi de 0,4198, e o fluxo gênico (Nm) foi de 0,6911 (Tabela

11).

Na análise de coordenadas principais (PCO) com todas as populações os três primeiros eixos correspondem a 64,40% da variância observada, sendo que o primeiro eixo explica 29,58% desta variância, separando as populações de P. ovalis das populações de P. contracta. O segundo eixo com apenas 18,15% de variação não separa nenhuma das populações (Fig. 15).

Na análise realizada através do HICKORY para obtenção dos valores referentes à estrutura populacional, segundo os valores obtidos para o DIC, foram escolhidos como modelos e que melhor explicam os padrões encontrados para os dados das onze populações analisadas Full e o f = 0. A diferença encontrada nos parâmetros para os modelos estão associadas à dimensionalidade dos modelos. Estes modelos indicam um provável efeito da endogamia (f = 0,8043) e diferenças nas freqüências alélicas entre as populações (uma vez que os valores para theta são considerados em ambos modelos). Os valores de theta II, theta III e theta B variaram para os dois modelos escolhidos, porém também indicam provável compartilhamento de alelos, uma vez que os valores obtidos variaram de moderados para o Full (theta II = 0,1560, theta III = 0,1374 e theta

B = 0,2463) e baixos para o f = 0 (theta II = 0,1068, theta III = 0,0994 e theta B =

0,1829) (Tabela 13).

Relações fenéticas

As análises de agrupamento obtidas a partir da distância genética (calculada pela distância não enviesada de Nei) e pelos valores de FST, estão representadas na figura 14.

Nas análises com a distância genética de Nei, os cladogramas obtidos para análise de UPGMA e NJ, mostram um suporte de 99% e 100% no agrupamento das populações de PO_RJPar e PO_SPUba. PC_ESLin e PC_ESCBar estão agrupadas com fraco suporte (65% - NJ) e abaixo de 50% na análise com UPGMA. As populações da Bahia não

apresentaram agrupamentos significativos na análise com a distância de Nei, em nenhum dos algoritmos utilizados.

Nas análises com FST, as populações do PO_RJPar e PO_SPUba também se

agruparam com 100% de bootstrap, e as populações de PC_ESLin e PC_ESCBar agruparam-se apenas na análise com NJ com 68% de valor de bootstrap. As populações da Bahia também não apresentaram agrupamentos significativos, apenas uma união entre Ilhéus e Maraú com 79% de bootstrap na análise com UPGMA.

Estas análises revelam uma separação entre as populações de P. ovalis (PO_RJPar e PO_SPUba) das populações de P. contracta (populações do Espírito Santo e Bahia), com valores de suporte de 100% para a análise com FST e 99-100% na análise

com a distância genética de NEI (Fig. 14).

Analisando os valores de identidade genética (Tabela 14), pode-se observar uma variação entre 0,810 (entre as populações de PC_ESLin e PO_SPUba) e 0,969 (entre as populações de PC_ESCBar e PC_ESLin) em populações não co-específicas. Entre populações co-específicas de P. ovalis por apresentar apenas duas populações, o valor de identidade genética foi de 0,855. Entre as populações de P. contracta o maior valor de identidade genética ocorreu entre as populações de PC_ESCBar e PC_ESLin (0,969) e o menor valor de identidade genética foi 0,923 entre as populações de PC_BABelm e PC_BAUna.

Tabela 10. Percentual de loci polimórficos por população (N= número de alelos

encontrados; P= loci polimórficos; He = heterozigosidade média esperada; PC=Passiflora contracta e PO= P. ovalis).

Espécie População No. Bandas (N) No. Bandas exclusivas %P He P. contracta PC_BABelm 7 0 _59.88% 0,177 P. contracta PC_BACam 17 0 _67.90% 0,180 P. contracta PC_BACon 16 1 _67.28% 0,185 P. contracta PC_BAIlh 16 0 _70.37% 0,177 P. contracta PC_BAImb 19 0 _63.58% 0,188 P. contracta PC_BAMar 16 1 _65.43% 0,174 P. contracta PC_BAUna 11 1 _56.17% 0,149 P. contracta PC_ESCBar 11 0 _53.70% 0,151 P. contracta PC_ESLin 6 0 _46.30% 0,141 P. ovalis _{PO_RJPar} 21 3 _17.28% 0,072 P. ovalis _{PO_SPUba} 25 1 _50.62% 0,167 Média 15 -- 56,23% --

Tabela 11. Variabilidade e diversidade genética média das populações do complexo P.

ovalis. P= percentual de loci polimórfico; HT = diversidade genética total; HS =

diversidade genética dentro das populações; GST = grau de diferenciação das

populações; FST = coeficiente de estruturação genética ao longo do tempo evolutivo, Nm

= número de migrantes por geração (fluxo gênico).

P. ovalis P. contracta Todas as populações

P 90,74 62,96 56,23 HT 0.3198 0.2203 0.2375 HS 0.2616 0.2053 0,1972 GST 0.4198 0.1308 0.2700 Nm 0.6911 3.3240 1.3519 FST 0,1639 0,0683 0,1713 Número de alelos 105 119 __ Alelos exclusivos 8 50 7

Variação entre populações 37% 13% 19%

Tabela 12. Sumário da Análise Molecular de Variância (AMOVA) para as populações

do complexo P. ovalis: df = grau de liberdade.

Fonte de Variação df Soma dos Quadrados Componentes da Variância Percentual de variação Estatística – F Entre Espécies 1 212.789 7.763 28% 0.282

Entre Populações/ Dentro

das Espécies 9 476.205 2.792 10% 0.141

Dentro das Populações 128 2171.655 16.966 62% 0.384

Total 138 2860.649 27.521

Tabela 13. Estrutura genética obtida no HICKORY versão 1.1 para as 11 populações do

complexo P. ovalis utilizadas na análise. Os valores em negrito correspondem aos prováveis modelos escolhidos pelo critério do DIC.

Modelos Parâmetros do DIC Parâmetros Equivalentes a Estatistica - F Dbar Dhat pD DIC F Theta I Theta II Theta III Theta B

Full 4165,96 3414,51 751,456 4917,42 0.804311 0.363646 0.156014 0.137476 0.246362 f = 0 4174,54 3360 814,532 4989,07 -- 0.270198 0.10681 0.099449 0.182952 Theta = 0 7680,71 7530,16 150,55 7831,26 0.986451 0.28007 -- -- --

Tabela 14. Matriz de identidade genética de Nei (1978) nas 11 populações do complexo P. ovalis. PC= Passiflora contracta; PO= Passiflora ovalis. Dados obtidos pelo GeneAlex. Em negrito os valores de maior e menor similaridade encontrados.

PC_BABe l PC_BACa m PC_BACo n PC_BAIl h PC_BAIm b PC_BAMa r PC_PC_BAUn a PC_ESCBa r PC_ESLi n PO_RJPa r PO_SPUb a PC_BABel - PC_BACam 0.931 - PC_BACon 0.934 0.949 - PC_BAIlh 0.941 0.938 0.943 - PC_BAImb 0.939 0.949 0.951 0.933 - PC_BAMar 0.954 0.959 0.949 0.965 0.946 - PC_PC_BAUn a 0.923 0.954 0.941 0.951 0.936 0.957 - PC_ESCBar 0.953 0.930 0.931 0.949 0.939 0.957 0.942 - PC_ESLin 0.957 0.935 0.929 0.944 0.945 0.958 0.940 0.969 - PO_RJPar 0.871 0.863 0.875 0.861 0.864 0.877 0.862 0.864 0.862 - PO_SPUba 0.819 0.812 0.829 0.813 0.822 0.819 0.830 0.827 0.810 0.855 -

Figura 14. Análise de agrupamento realizado para as onze populações estudadas

utilizando o algorítimo de UPGMA e Neighbor-joining (NJ) a partir da distância genética de Nei (1978) pelo método não enviesado e pelos valores de FST (Wright

1978) par a par. Os valores sobre os ramos indicam o suporte estatístico de

bootstrap. A. FST – NJ; B. FST – UPGMA; C. NEI – NJ; D. NEI – UPGMA. (Tabela

-0.4 -0.35 -0.3 -0.25 -0.2 -0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 Axis 1 -0.2 -0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Ax is 2

Figura 15. Análise de Coordenadas Principais (PCO) com as 11 populações do

complexo Passiflora ovalis, baseado nos 163 loci de ISSR, considerando duas espécies

▲ P. ovalis e

+

P. contracta, a partir da matriz de distância genética de Nei (Nei 1978).

Discussão

A utilização dos marcadores moleculares de ISSR neste estudo se mostrou uma ótima ferramenta no estudo de variabilidade intra e interpopulacional. Os resultados foram considerados superiores no sentido de indicar caminhos para o esclarecimento sobre o posicionamento taxonômico das espécies do complexo P. ovalis.

Passos (2007) utilizando marcadores moleculares de ISSR para analisar as espécies P. galbana e P. mucronata detectou um percentual baixo a médio de loci polimórficos entre 14,81% e 36,11%, com uma média de 29,92%. No presente trabalho o percentual foi maior, sendo que a média encontrada foi de 56,23%, variando entre 17,28% (PO_RJPar) a 70,37% (PC_BAIlhe). A baixa quantidade de indivíduos analisados para a população de PO_RJPar pode ser responsável pelo baixo percentual de

loci polimórficos.

Os resultados obtidos com os valores de fluxo gênico indicam um alto nível de fluxo gênico ocorrendo dentro das espécies, e um fluxo num nível mais baixo entre as

(10%) e entre espécies (28%) indicam um fluxo gênico menor na relação entre as espécies do que entre as populações dentro das espécies. Estes resultados também foram os mesmos encontrados por Passos (2007), demonstrando que ocorre fluxo gênico ou ocorreu em um passado recente com as populações de P. mucronata e P. galbana. Valores de fluxo gênico menores que 1 indicam isolamento geográfico, considerados por alguns autores com fluxo gênico alto (Govindajaru 1989), sendo os valores

No documento TEONILDES SACRAMENTO NUNES (páginas 81-99)