Atualmente o Multi Locus Sequence Typing (MLST) tem sido o método mais aplicado para genotipagem de Cryptococcus e pode ser utilizado como ferramenta de epidemiologia molecular. Apresenta maior acurácia na determinação dos genótipos do que as técnicas anteriores baseadas apenas em PCR, já que realiza o sequenciamento e identificação de polimorfismos presentes em sequências de múltiplos genes conservados, utilizando recursos de bioinformática. Além de apresentar uma maior capacidade de discriminação entre cepas de um mesmo genótipo, a grande vantagem do MLST está na sua reprodutibilidade e por gerar dados
de alta qualidade que podem ser compartilhados pela internet e aplicados em análises filogenéticas, evitando a troca de cultivos entre laboratórios e consequentemente agilizando a realização de estudos moleculares e no aumento do conhecimento microbiológico e genético de patógenos de importância para a saúde pública (74).
O MLST tem sido aplicado para a vigilância epidemiológica da criptococose em nível mundial, principalmente na investigação de surtos. Também tem permitido a identificação de novos genótipos (Quadro 1) e a realização de estudos sobre a estrutura populacional microbiana dessas leveduras. A utilização das informações geradas pelo MLST em análises filogenéticas podem ajudar a estimar a origem evolutiva desses patógenos, na avaliação de relações de parentesco genético entre isolados obtidos de diferentes regiões, auxiliando na triagem da sua disseminação global, na detecção de recombinações que podem ser refletidas em mudanças fenotípicas e de patogênese (31,65,66,75,76).
Quadro 1. Genótipos e sub-genótipos dos agentes da criptococose.
Espécies Sorotipos Genótipos
(PCR) Exemplos de sub-genótipos (STs) Definidos por MLST Total de STs depositados no banco de dados Ref C. neoformans Sorotipo A (C. var. grubii) VNI ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, ST6, ST15, ST23, ST31, ST32, ST39, ST58, ST63, ST67, ST69, ST71, ST77, ST93, ST185, ST199, ST200, ST202, ST212, ST218, ST234, ST235, ST236, ST237, ST238, ST239, ST240, ST241, ST246, ST247, ST540 173 (76–82) VNII ST40, ST41, ST42, ST43, ST48, ST60, ST97, ST100, ST107, ST172, ST173, ST207, ST208, ST209, ST220, ST221, ST222, ST242, ST244, ST243, ST262 26 (76–80) VNB ST8, ST9, ST10, ST11, ST14, ST16, ST17, ST18, ST19, ST20, ST27, ST29, ST33, ST35, ST210, ST245, ST249, ST261, ST263, ST295, 102 (75–78) Sorotipo D (C. var. neoformans) VNIV ST108, ST112, ST114, ST117, ST119, ST120, ST121, ST122, ST126, ST129, ST131, ST132, ST134, ST135, ST160, ST251, ST252, ST294, 79 (79–81,83) Sorotipo AD (Híbrido - diplóide)
VNIII MLST não é realizado
MLST não é realizado C. gattii Sorotipos B e C VGI ST4, ST51, ST58, ST159, ST332 88 (80,84–86) VGII ST3, ST5, ST8, ST12, ST18, ST21, ST25, ST29, ST31, ST33, ST35, ST37, ST44, ST45, ST46, ST48, ST50, ST182, ST283,ST321, ST322, ST323, ST324, ST168, ST169, ST170, ST250, ST251 Brasil ST1, ST4, ST9, ST10, ST11, ST13, ST14, ST15, ST16, ST17, ST19, ST22, ST23, ST24, ST26, ST27, ST28, ST34, ST39, ST40, ST41, ST120, ST122, ST124, ST128, ST134, ST277, ST311, ST316. Identificados no Amazonas ST5, ST46, ST264, ST265, ST266, ST267, ST268, ST172, ST288 167 (61,62,66,84,85,87) VGIIa ST20 (53,61,88) VGIIb ST7 (53,61,79,88) VGIIc ST6 (65,88) VGIII ST60, ST62, ST68, ST72, ST74, ST75, ST143, ST145 68 (79,80,84,86) VGIV ST1, ST2, ST70 21 (79,84,86)
Na primeira investigação com o MLST foram analisados 102 isolados de C. neoformans var. grubii obtidos de diferentes países, incluindo Botswana na África e para caracterização foram empregados 12 loci: CAP10, CAP59, GPD1, LAC1, MPD1, MP88, SOD1, TEF1α, TOP1, URE1 e a região IGS1 do DNA ribossomal, presentes em diferentes cromossomos. O MLST identificou três grupos geneticamente distintos, sendo VNI, VNII e um novo genótipo denominado de VNB e de sorotipo A (Variedade neoformans de Botswana), encontrado exclusivamente em isolados desta região (75). Um segundo estudo usou inicialmente nove loci, sendo dois responsáveis pelos tipos sexuados para caracterizar 202 isolados clínicos e ambientais de C. gattii com o objetivo de investigar as causas do surto em Vancouver. O MLST confirmou a existência dos dois novos sub-genótipos VGIIa e VGIIb identificados previamente por RAPD, sendo estes geneticamente semelhantes entre si e extremamente divergentes dos demais tipos moleculares de C. gattii (31).
Pela análise dos lócus dos mating types foi demonstrado que os tipos VGIIa e VGIIb foram gerados por recombinação induzida por reprodução sexuada entre duas cepas ancestrais VGII com o mesmo tipo sexuado α. Para comparar estes isolados com cepas obtidas de outras regiões foram analisados 22 loci adicionais que revelaram semelhanças genéticas com um isolado da Austrália e do Brasil, sugerindo que a cepa recombinante ancestral tenha se originado nessas regiões (31).
Baseado nos resultados obtidos com os dois estudos anteriores, um grupo de pesquisadores em criptococose definiram por consenso durante um evento em 2007 que para uma caracterização concreta era necessário a análise em conjunto de no mínimo sete loci polimórficos e capazes de gerarem distinção entre isolados relacionados. Foram definidos para caracterização pelo MLST a amplificação e sequenciamento dos lócus: CAP59 (responsável pela cápsula polissacarídica), LAC1 (lacase), PLB1 (fosfolipase), SOD1 (superóxido dismutase), sendo estes genes relacionados a expressão de fatores de virulência, assim como os lócus URA5, GPD1 (gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase) e a região IGS1(espaço intergênico) (74).
Uma parte do procedimento de genotipagem é realizada no Banco de dados Fungal MLST Database coordenado pela Sociedade Internacional de Micologia Médica e Veterinária (ISHAM). As sequencias de interesse são comparadas por alinhamento com outras sequencias de referência, permitindo a detecção de
alterações nucleotídicas que passam a ser consideradas como novos alelos e aos mesmos é atribuído um número. A combinação desses códigos geram um perfil alélico e consequentemente o genótipo denominado de sequence type (ST) (74).
A partir de 2006 começaram a surgir casos novos de criptococose por C. gattii em Washington e Oregon no noroeste pacífico dos EUA e o MLST foi utilizado na caracterização dos isolados (N=22), sendo identificadas cepas do tipo VGIIa, VGIIb, o que indicou uma possível disseminação dos isolados de Vancouver para esta região. (65).
Um total de 178 isolados de C. gattii VGII obtidos de diferentes países, incluindo amostras relacionadas aos microsurtos na América do Norte e também isolados ambientais do Brasil foram analisados por MLST e análise filogenética de ancestralidade(66). Isolados da América do Sul apresentaram os maiores índices de recombinações genéticas no seu histórico evolutivo e deram origem as cepas circulantes atualmente, inclusive as presentes em Vancouver e nos EUA que se disseminaram por meios ainda não esclarecidos e que provavelmente as alterações ecológicas e mudanças climáticas tenham contribuído nesse processo e para o atual surgimento e emergência desses micro-organismos em novos nichos, representando um agravo para a saúde da população mundial, já que podem acometer indivíduos saudáveis (66).
A cepa considerada mais ancestral (ST26) foi isolada em 2001 em uma árvore na Floresta da Ilha de Maracá em Roraima, demonstrando que a região Amazônica é uma fonte em potencial de micro-organismos patogênicos, cuja diversidade ainda é desconhecida (66,89).
Um estudo comparou 183 isolados clínicos e ambientais de C. neoformans var. grubii da Tailândia com outros 77 isolados da mesma espécie obtidos em outros países. Foram identificados 10 STs (ST43 a ST53), sendo todos correspondentes a VNI, os STs 44, 45 e 46 foram mais prevalentes respectivamente e quando comparados aos isolados globais, principalmente da África foi observada uma baixa diversidade. E pela análise filogenética foi sugerida uma origem Africana para os isolados de C. neoformans circulantes nesse país (90).
Foi observada uma associação de STs com a condição imunológica de indivíduos com criptococose na Ásia. Em pacientes HIV positivos foram identificados
14 tipos de STs de C. neoformans var. grubii, sendo os STs 4, ST6, ST93 e ST5 mais prevalentes consecutivamente. Em HIV negativos o ST5 também foi o mais frequente dentre 20 STs identificados (76).
No estudo pioneiro de genotipagem com MLST no Amazonas foram analisadas 45 cepas ambientais de C. gattii VGII obtidas de três amostras de poeira domiciliar em casas de madeira no munícipio de Santa Isabel do Rio Negro. Foram identificados oito STs, sendo o ST20 de VGIIa (n=11) e ST7 de VGIIb (n=22), os mesmos caracterizados em Vancouver e nos EUA. Isolados do tipo VGII (n=12) apresentaram os ST5 (n=2), ST264 (n=6), sendo este único do Brasil e os ST265, ST266, ST267, ST268 (n=1 de cada) descritos como novos genótipos (61). Os resultados deste estudo também demonstraram que isolados com diferentes genótipos podem coabitar o mesmo habitat já que mais de 3 tipos de STs foram identificados em isolados de duas amostras de poeira, sugerindo que indivíduos expostos a tais fontes podem vir a desenvolver infecções mistas.
Investigação semelhante ao estudo anterior foi realizada por Alves (2016)(62) que isolou C. neoformans (VNI) e C. gattii (VGII) a partir da poeira domiciliar de residências em uma comunidade rural do município de Iranduba, na região metropolitana de Manaus e por MLST foram identificados pela primeira vez o ST46 de C. gattii e o ST93 de C. neoformans na nossa região. Tais pesquisas regionais evidenciaram o risco de infecção intradomiciliar pelos agentes da criptococose que pode se estender a todos os membros de um grupo familiar, principalmente para os que apresentam deficiências imunológicas. E especificamente na região amazônica onde são típicas as moradias de madeira e as próprias condições ambientais podem possibilitar o desenvolvimento de Cryptococcus. O risco de infecção da população ribeirinha, das periferias e principalmente do ambiente rural necessita ser avaliado já que estão em área endêmica.
No Brasil, as pesquisas sobre a epidemiologia molecular da criptococose tem propósitos biológicos, visando investigar a diversidade genética e de situar os isolados obtidos em diferentes regiões do país em um contexto global com o intuito de triar as suas origens evolutivas e de avaliar os mecanismos que contribuíram para o surgimento de cepas com novos genótipos e mais virulentas atualmente, no entanto estudos de genotipagem por MLST ainda são escassos no Brasil (82,87).
Destaca-se a investigação multicêntrica realizada por Souto et al. (2016) (87) que caracterizaram os STs de 145 isolados VGII de origem clínica e ambiental obtidas em 8 estados, incluindo o Amazonas. Um alto índice de diversidade genética foi observado, já que foram caracterizados 81 STs para o genótipo VGII, sendo os isolados da região nordeste os que apresentaram o maior índice de diversidade (total de 31 STs). Em nível nacional os STs 40, ST20 e ST5 foram os mais prevalentes respectivamente. Este estudo também foi o primeiro a realizar a sub-tipagem de isolados clínicos VGII do Amazonas, sendo identificados os STs 5, ST20 (VGIIa), ST7 (VGIIb), ST288 e ST274 em um total de 10 cepas analisadas.
Em relação a genotipagem e filogenia de cepas de C. neoformans VNI, Ferreira-Paim et al. (2017)(82) observaram uma condição contrária ao analisarem 143 isolados clínicos e ambientais obtidos em Uberaba, Minas Gerais. Apenas 13 STs foram identificados, sendo o ST93 (encontrado previamente no Amazonas) e ST77 os mais prevalentes respectivamente e, o ST540 foi definido como um novo genótipo. Concluiu-se que as cepas VNI apresentaram pouca variabilidade genética e características de expansão clonal. Por métodos filogenéticos foi observada uma relação ancestral com isolados do genótipo VNB de origem africana.