O camundongo mdx, modelo animal para a DMD

O camundongo mdx (X-linked muscular dystrophy ) ´e o modelo animal mais comum para a DMD [54]. A linhagem mdx ´e isogˆenica e foi selecionada a partir de uma muta¸c˜ao espontˆanea observada em camundongos saud´aveis da linhagem C57Black/10ScSn. Os camun- dongos mdx foram identificados por apresentarem elevados ´ındices de creatina quinase e piruvato quinase no sangue, al´em de apresen- tarem caracter´ısticas de m´usculos distr´oficos em an´alise histol´ogica [55]. Os camundongos mdx apresentam muta¸c˜ao no gene da dis- trofina, no ´exon 23, que provoca a ausˆencia desta prote´ına em suas c´elulas [56]. A ausˆencia da distrofina leva a uma redu¸c˜ao secund´a- ria das prote´ınas associadas `a distrofina, assim como nos pacientes com DMD [57]. Os camundongos mdx, entretanto, apresentam uma distrofia muito mais branda que a encontrada em humanos, s˜ao vi´aveis, se reproduzem e tˆem expectativa de vida pr´oxima `a de um camundongo saud´avel [55].

Os diferentes grupos musculares dos camundongos mdx apre- sentam comprometimento em graus variados, sendo que em geral os m´usculos r´apidos s˜ao mais afetados por les˜oes induzidas por es- tresse mecˆanico [58, 59]. Entre os m´usculos esquel´eticos, o mais afetado ´e o diafragma, que apresenta o padr˜ao de degenera¸c˜ao, ne- crose e substitui¸c˜ao por tecido conjuntivo observado nos m´usculos dos membros de pacientes com DMD. Em torno de 1 ano e meio de idade, os m´usculos acess´orios da respira¸c˜ao dos camundongos mdx passam a apresentar as mesmas caracter´ısticas observadas no dia- fragma aos 6 meses de idade. A atividade respirat´oria por unidade de massa ´e proporcional `a massa do animal elevada a −0, 22 [60]. Assim, quanto menor a massa do animal em quest˜ao maior a ati- vidade muscular envolvida na respira¸c˜ao. Uma vez que a ausˆencia de distrofina leva a uma menor resistˆencia das fibras musculares ao estresse mecˆanico causado pela atividade f´ısica, o diafragma seria um m´usculo mais sens´ıvel `a ausˆencia desta prote´ına em animais de pequeno porte devido `a sua maior atividade quando comparados a animais de maior massa [60]. O diafragma ainda mostra com- prometimento variado de acordo com a regi˜ao analisada: a regi˜ao

crural apresenta-se mais severamente afetada pela distrofia que a regi˜ao costal [61].

Al´em do diafragma, m´usculos dos membros posteriores dos ca- mundongos mdx, como o gastrocnˆemio, s˜ao largamente estuda- dos. Nos camundongos mdx, o grupo muscular gastrocnˆemio apre- senta poucos focos de degenera¸c˜ao-regenera¸c˜ao em an´alise histol´o- gica nas primeiras duas semanas de vida. O n´umero de focos de degenera¸c˜ao-regenera¸c˜ao aumenta progressivamente, atingindo um pico em cerca dois a trˆes meses de idade, quando h´a numerosos fo- cos de necrose envolvendo n´umero variado de fibras. Entre trˆes e seis meses de idade o processo necr´otico diminui progressivamente, com focos necr´oticos contendo uma ou poucas fibras, al´em de ha- ver muitas fibras centronucleadas. Ap´os os seis meses de idade, h´a progressiva varia¸c˜ao no calibre das fibras e deposi¸c˜ao de fibrilas de col´ageno nos gastrocnˆemios de camundongos mdx [62, 63]. Outros m´usculos dos membros posteriores, como o tibial anterior, o exten- sor digital longo e o plantar apresentam um padr˜ao semelhante de degenera¸c˜ao-regenera¸c˜ao muscular, por´em com in´ıcio ligeiramente mais tardio [63]. J´a os m´usculos envolvidos na mastiga¸c˜ao, como o masseter, s˜ao mais brandamente acometidos [64].

Acredita-se que uma redu¸c˜ao no processo de necrose seja uma das causas do fen´otipo mais brando observado nos camundongos mdx em compara¸c˜ao com os pacientes com DMD [62, 65]. Al´em disso, o fen´otipo mais brando observado nos camundongos mdx tem sido atribu´ıdo a uma maior capacidade de regenera¸c˜ao muscular destes animais. Esta hip´otese pode ser fundamentada na observa- ¸c˜ao de camundongos mdx irradiados com baixas doses de radia¸c˜ao gama, o que bloqueia os processos de regenera¸c˜ao. Os animais ir- radiados apresentam les˜oes musculares semelhantes `as observadas em pacientes com DMD em est´agio avan¸cado da doen¸ca [66, 67]. H´a ainda trabalhos na literatura mostrando que ap´os um ciclo de degenera¸c˜ao-regenera¸c˜ao as fibras musculares se tornariam mais resistentes `a necrose, e tal fato foi atribu´ıdo a uma maior resistˆen- cia das fibras de menor calibre ao estresse mecˆanico causado pela contra¸c˜ao muscular [68, 69].

3.5

A espectroscopia por RMN no estudo das

distrofias musculares com ausˆencia de dis-

trofina

H´a diversos trabalhos na literatura em que s˜ao estudadas carac- ter´ısticas metab´olicas e morfofuncionais em distrofias atrav´es de espectroscopia e imageamento por ressonˆancia magn´etica nuclear (RMN), mas at´e o momento n˜ao existe um protocolo definido para uso cl´ınico [11, 5, 14, 70, 22]. A RMN ´e uma t´ecnica promissora por ser n˜ao invasiva e segura para uso em medicina, uma vez que n˜ao envolve uso de radia¸c˜ao ionizante. Diferentes t´ecnicas de RMN permitem a obten¸c˜ao de imagens de tecidos moles com alta quali- dade e possibilitam a an´alise metab´olica atrav´es da espectroscopia. Espectroscopia por RMN in vivo de f´osforo-31 (31_{P) tem sido}

largamente utilizada no estudo do metabolismo muscular energ´e- tico em diferentes doen¸cas neuromusculares [71, 72]. A espectros- copia por RMN de 31_{P tem destaque na an´alise de fosfatos de alta}

energia (fosfocreatina, ADP, ATP e propor¸c˜ao de fosfato inorgˆa- nico) e de pH. Em pacientes com DMD e DMB, observa-se elevado pH intracelular e elevada raz˜ao f´osforo inorgˆanico / fosfocreatina em repouso, o que indica deficiˆencia no metabolismo energ´etico [19, 20]. H´a diversos trabalhos na literatura envolvendo an´alise me- tab´olica de camundongos mdx, tanto in vivo como in vitro, atrav´es da espectroscopia por RMN de 31_{P em diferentes est´agios de evo-}

lu¸c˜ao da doen¸ca e do m´usculo sadio, em condi¸c˜ao de repouso e de atividade f´ısica intensa [15, 16, 17, 18].

Atrav´es da espectroscopia por RMN de hidrogˆenio (1_{H) ´e pos-}

s´ıvel a identifica¸c˜ao e a quantifica¸c˜ao de metab´olitos de diferentes vias bioqu´ımicas, como glicose, creatina, lip´ıdeos, lactato, acetato, entre outros. Sharma e colaboradores [14] aplicaram a espectros- copia de 1_{H NMR uni e bi-dimensional ao estudo de extratos de}

bi´opsias musculares de pacientes com DMD e observaram altera- ¸c˜oes nas concentra¸c˜oes de diversos metab´olitos em compara¸c˜ao com controles. Foi observada redu¸c˜ao nas concentra¸c˜oes de glicose, lac- tato e amino´acidos gliconeogˆenicos, como glutamina e alanina. A redu¸c˜ao na glicose foi associada `a redu¸c˜ao na concentra¸c˜ao dos substratos para a gliconeogˆenese (alanina, glutamina) e a anomalias na membrana dos m´usculos dos pacientes com DMD. Foi observada redu¸c˜ao nos n´ıveis de lactato, possivelmente devido a uma menor atividade glicol´ıtica anaer´obica nos pacientes. Esta preferˆencia pelo

metabolismo oxidativo para a gera¸c˜ao de energia nos pacientes com DMD tamb´em justificaria a observa¸c˜ao de α-cetoglutarato, um in- termedi´ario do ciclo de Krebs, apenas nos pacientes com DMD. Tamb´em foi observada redu¸c˜ao nas concentra¸c˜oes de acetato e car- nitina, resultados relacionados uma vez que a carnitina ´e necess´aria para o transporte de ´acidos graxos para o interior da mitocˆondria, onde ocorre a β-oxida¸c˜ao e forma¸c˜ao de acetato e propionato. Por fim, foi observada redu¸c˜ao nas concentra¸c˜oes de glicerofosforilco- lina, fosforilcolina e colina nos pacientes com DMD, o que provo- caria uma sequˆencia de altera¸c˜oes que acarretam em modifica¸c˜oes na composi¸c˜ao dos fosfolip´ıdeos da membrana celular. Tais ano- malias na membrana contribuiriam para a doen¸ca, uma vez que os fosfolip´ıdeos da membrana tˆem fun¸c˜ao estrutural e contribuem na regula¸c˜ao da atividade de enzimas ligadas `a membrana.

Griffin e colaboradores realizaram experimentos in vitro em fragmentos de tecido card´ıaco de camundongos mdx atrav´es de espectroscopia por RMN de 1_{H em estado s´olido em uma e duas}

dimens˜oes [73], al´em de an´alise metab´olica de tecidos musculares de camundongos mdx, incluindo diafragma e cora¸c˜ao [10]. Nes- tes estudos, foram observados padr˜oes metab´olicos distintos em tecido card´ıaco, m´usculos esquel´eticos e no cerebelo e c´ortex cere- bral. Foram identificados diversos metab´olitos capazes de diferen- ciar tecidos distr´oficos e de controle, provenientes de diferentes vias metab´olicas, como glic´olise, β-oxida¸c˜ao, metabolismo de lip´ıdeos, osmorregula¸c˜ao e outros. Tais vias metab´olicas provavelmente s˜ao alteradas pelo rompimento da membrana celular e pelas altera¸c˜oes no influxo de Ca2+_{, que alteram a osmorregula¸c˜ao e homeostase.}

Rae e colaboradores [74] observaram eleva¸c˜ao na concentra¸c˜ao de compostos contendo colina em espectroscopia por RMN de 1_{H in}

vivo do c´erebro de pacientes com DMD em compara¸c˜ao com con- troles. Altera¸c˜oes nas concentra¸c˜oes de compostos contendo colina foram observadas em diversas outras patologias, al´em de serem ob- servadas em experimentos envolvendo eletropora¸c˜ao de c´elulas, o que sugere que o acompanhamento de varia¸c˜oes nas concentra¸c˜oes de compostos contendo colina pode permitir o monitoramento de altera¸c˜oes na estabilidade da membrana celular [75]. Griffin e co- laboradores [76] ainda observaram atrav´es de espectroscopia por RMN de 1_{H in vitro padr˜oes metab´olicos distintos em diafragma e}

cora¸c˜ao de camundongos mdx com express˜ao variada de utrofina, e em amostras de diafragma de camundongos mdx e de controle com diferentes idades. Neste caso, observou-se redu¸c˜ao na concentra¸c˜ao

de creatina e aumento na concentra¸c˜ao de taurina com a evolu¸c˜ao da doen¸ca.

McIntosh e colaboradores [12] observaram diferen¸cas entre m´us- culo sadio e distr´ofico de diferentes idades al´em de diferen¸cas em m´usculos distr´oficos ap´os tratamento com glicocortic´oides atrav´es de espectroscopia de 1_{H RMN ex vivo. Foram observados n´ıveis}

mais baixos de creatina e de taurina nos camundongos mdx na chamadas fases pr´e-distr´ofica (menos de 3 semanas) e distr´ofica (3 a 6 semanas). Os n´ıveis de taurina aumentaram com a estabiliza- ¸c˜ao da doen¸ca e apresentaram correla¸c˜ao com o n´umero de fibras centronucleadas, caracter´ıstica de regenera¸c˜ao muscular. O dia- fragma apresentou elevados n´ıveis de lip´ıdeos quando comparado aos m´usculos dos membros. Ap´os tratamento com glicocortic´oi- des, observou-se eleva¸c˜ao nos n´ıveis de taurina e creatina, especi- almente nos m´usculos dos membros. A taurina e a creatina foram identificadas como marcadores consistentes para o processo de re- genera¸c˜ao muscular nos camundongos mdx, enquanto a taurina foi considerada um bom marcador para a resposta ao tratamento com glicocortic´oides, o que permitiu relacionar a taurina a uma maior estabilidade da membrana celular e regenera¸c˜ao das c´elulas mus- culares, como observado em morfometria. O m´etodo foi capaz de diferenciar mesmo animais controles de camundongos mdx com me- nos de trˆes semanas de idade, fase em que dificilmente os tecidos s˜ao identificados por histologia. Em outro trabalho, McIntosh e co- laboradores mostraram que h´a correla¸c˜ao entre os n´ıveis de taurina observados em espectroscopia por RMN de 1_{H in vitro e ex vivo}

e a extens˜ao de tecido regenerado em m´usculo esquel´etico [13]. A taurina apresenta diversas fun¸c˜oes metab´olicas, estando envolvida na regenera¸c˜ao muscular, na estabiliza¸c˜ao de membranas celulares, na homeostase do Ca2+_{, al´em de atuar como neurotransmissor [77].}

Radda e colaboradores [35] e Tracey e colaboradores [78], entre outros, utilizaram a espectroscopia de RMN de 1_{H in vitro e in}

vivo no estudo do sistema nervoso central de camundongos mdx. Cole e colaboradores [79] observaram altera¸c˜oes em espectroscopia por RMN de 31_{P e} 1_{H compat´ıveis com anomalias no controle da}

concentra¸c˜oes iˆonicas dentro e fora das c´elulas musculares de ca- mundongos mdx e em camundongos duplos mutantes com ausˆencia de distrofina e utrofina.

Misra e colaboradores observaram diferen¸cas no valor de T1 en-

tre os m´usculos de galinhas distr´oficas e de controle [80]. Walter e colaboradores [23] avaliaram atrav´es de imageamento e espectros-

copia por RMN o tecido muscular de camundongos mdx, controles e nockout para γ−sarcoglicana (γsg-/-) com e sem terapia gˆenica. Os autores observaram varia¸c˜oes nos tempos de relaxa¸c˜ao trans- versal (T2) compat´ıveis com o n´ıvel de degenera¸c˜ao muscular e n˜ao

relacionadas com o grau de infiltra¸c˜ao por tecido adiposo, permi- tindo uma avalia¸c˜ao n˜ao invasiva do grau de inflama¸c˜ao e necrose do tecido, al´em de observarem melhorias nos m´usculos tratados com terapia gˆenica atrav´es de imagens com contraste. H´a ainda diversos outros trabalhos envolvendo rastreamento de c´elulas tronco atra- v´es de RMN [81, 82] e o acompanhamento in vivo da express˜ao de gene reporters [83].

Considerando a viabilidade da aplica¸c˜ao de m´etodos espectros- c´opicos de RMN no estudo de distrofias musculares, este trabalho visa o estabelecimento de uma metodologia padr˜ao para o uso de espectroscopia de RMN de 1_{H na avalia¸c˜ao do est´agio da doen¸ca e}

Cap´ıtulo 4

Procedimentos Experimentais

4.1

Animais

Os animais utilizados foram cedidos pelo biot´erio de cria¸c˜ao e ma- nuten¸c˜ao do Departamento de Patologia da Faculdade de Medi- cina Veterin´aria e Zootecnia da USP, em parceria com o Centro de Estudos do Genoma Humano - Instituto de Biociˆencias da USP. Foram utilizados camundongos C57Black -mdx (mdx ) e C57Black - selvagem (Ctrl ). Os animais foram mantidos em ambiente con- trolado, com sistema de ar condicionado central para ventila¸c˜ao e exaust˜ao, ilumina¸c˜ao controlada 12 horas claro/12 horas escuro, temperatura mantida em 22◦

C, com ra¸c˜ao e ´agua `a vontade.

Ao todo foram eutanasiados 45 animais em cˆamara de CO2,

sendo 12 camundongos mdx com 3 meses de idade, 11 camundongos Ctrl com 3 meses de idade, 12 camundongos mdx com 6 meses de idade e 10 camundongos Ctrl com 6 meses de idade. O estudo re- cebeu autoriza¸c˜ao do Comitˆe de ´Etica em Experimenta¸c˜ao Animal do Instituto de Ciˆencias Biom´edicas da Universidade de S˜ao Paulo.

4.2

Prepara¸c˜ao das Amostras

Foram coletados os m´usculos quadr´ıceps femural e diafragma dos animais ap´os eutan´asia. Foram coletados os quadr´ıceps bilaterais, sendo que para cada animal um dos quadr´ıceps foi utilizado para o estudo de espectroscopia por RMN e o m´usculo contralateral foi armazenado para an´alise histol´ogica. Os diafragmas coletados foram divididos sagitalmente em duas partes, de modo que cada uma delas contivesse tanto parte do diafragma costal como parte

do diafragma crural. Uma das partes foi reservada para o estudo de espectroscopia por RMN e a outra foi reservada para an´alise his- tol´ogica. Os tecidos pr´oprios para ERMN foram congelados em N2

l´ıquido e mantidos a −70◦

C at´e sua utiliza¸c˜ao. Os tecidos pr´oprios para an´alise histol´ogica foram crioprotegidos com talco, fixados em bloco de corti¸ca e congelados em N2 l´ıquido. O material para an´a-

lise histol´ogica foi mantido em N2 l´ıquido at´e a sua utiliza¸c˜ao.

Para a prepara¸c˜ao das amostras para espectroscopia por RMN de quadr´ıceps femural, cada m´usculo foi triturado em 2 ml de so- lu¸c˜ao de ´agua destilada e acetonitrila 1:1, com o uso de um mixer Polytron PT1200. Durante este processo as amostras foram man- tidas imersas em gelo. Ap´os homogeneiza¸c˜ao, as amostras foram centrifugadas em centr´ıfuga refrigerada a 4◦

C a 13200 rpm, por ao menos 40 minutos. O sobrenadante foi ent˜ao liofilizado, por aproxi- madamente 24 horas, no Laborat´orio de Liofiliza¸c˜ao do Instituto de Farm´acia e Bioqu´ımica da USP. Ap´os a liofiliza¸c˜ao, o p´o obtido foi pesado e ressuspendido em 0, 7 ml de solu¸c˜ao de TSP (trimetilsilil propionato de s´odio - Sigma) e D2O (Sigma) a 10 mM. As amos-

tras foram mantidas a −70◦

C at´e a realiza¸c˜ao dos experimentos de espectroscopia por RMN.

O procedimento de prepara¸c˜ao das amostras de diafragma para espectroscopia por RMN foi semelhante. O tecido, em muito me- nor quantidade quando comparado ao m´usculo quadr´ıceps femural, foi triturado em apenas 1 ml de solu¸c˜ao de ´agua destilada e ace- tonitrila 1:1, com aux´ılio de um mixer Polytron PT1200. Depois de homogeneizadas, as amostras foram centrifugadas em centr´ıfuga refrigerada a 4◦

C, a 13200 rpm, por 160 minutos, com o objetivo de se obter amostras menos turvas que as amostras de quadr´ıceps, o que resultaria em melhores resultados para as medidas de es- pectroscopia por RMN. O sobrenadante foi ent˜ao liofilizado e em seguida o p´o obtido foi pesado e ressuspendido em solu¸c˜ao de TSP e D2O a 10 mM.

4.3

Metodologias de Espectroscopia por RMN

4.3.1

Medidas de tempo de relaxa¸c˜ao longitudinal T1

(spin-rede)

Uma das formas de se obter espectros de RMN com alta raz˜ao sinal-ru´ıdo ´e realizar sucessivas aquisi¸c˜oes de sinal e calcular a m´e-

dia das mesmas para gerar o FID. Neste caso, ´e preciso evitar a condi¸c˜ao de satura¸c˜ao da magnetiza¸c˜ao entre as sucessivas aquisi- ¸c˜oes de sinal. No experimento de RMN, depois de algumas medidas aplicando-se um pulso de RF de 90◦

a magnetiza¸c˜ao ao longo do eixo z, Mz, evolui de acordo com a Equa¸c˜ao 2.47. A fim de se ga-

rantir que a magnetiza¸c˜ao no eixo z sempre partir´a do seu estado de equil´ıbrio durante o processo cumulativo de medida, ´e ajustado na sequˆencia de pulso utilizada no experimento de RMN um valor de tempo de repeti¸c˜ao (TR) entre a 3 e 5 vezes o valor de T1. Para a

determina¸c˜ao experimental do valor de T1 podem ser utilizadas di-

ferentes sequˆencias de pulso, sendo que neste trabalho foi utilizado o m´etodo de invers˜ao-recupera¸c˜ao.

O m´etodo de invers˜ao-recupera¸c˜ao consiste na aplica¸c˜ao de um pulso de 180◦

que posiciona a magnetiza¸c˜ao na dire¸c˜ao de −z (inver- s˜ao da magnetiza¸c˜ao) seguido de um intervalo de tempo vari´avel em que a magnetiza¸c˜ao tende a voltar `a condi¸c˜ao inicial, de acordo com a Equa¸c˜ao 2.48. Ap´os o intervalo de recupera¸c˜ao τ , um pulso de 90◦

´

e aplicado, posicionando a magnetiza¸c˜ao no plano transversal e permitindo a obten¸c˜ao do FID. Quando o tempo de recupera¸c˜ao for zero, a magnetiza¸c˜ao que se encontrava em −z ´e excitada e se orienta paralela a −y. Nesta condi¸c˜ao, observa-se uma linha in- vertida no espectro de RMN com intensidade negativa m´axima. Quando o tempo de recupera¸c˜ao for da ordem de 3 a 5 vezes T1, a

magnetiza¸c˜ao ter´a retornado `a posi¸c˜ao inicial, na dire¸c˜ao de +z, e ap´os o pulso de 90◦

se posicionar´a na dire¸c˜ao de +y, dando origem a uma linha de intensidade positiva m´axima no espectro de RMN. Com um gr´afico da amplitude da linha de ressonˆancia em fun¸c˜ao do tempo τ , pode-se ajustar a curva `a equa¸c˜ao 2.48 e obter o valor de T1. Alternativamente, pode-se calcular o valor de T1 obtendo-se

o tempo exato em que a intensidade do pico de ressonˆancia vale zero, t0, e calcular o valor de T1 a partir da equa¸c˜ao

T1 =

t0

ln2. (4.1)

Para a determina¸c˜ao do tempo de espera a ser utilizado nas sequˆencias de pulsos, foi realizado um experimento de medida de T1 em uma das amostras (Mdx 36-diafragma) com o m´etodo de

invers˜ao-recupera¸c˜ao. A sequˆencia consistia na aplica¸c˜ao de um pulso de 180◦

(invers˜ao) seguido por um tempo de recupera¸c˜ao vari´avel e por um pulso de 90◦

(Figura 4.1). Foi selecionado o metab´olito com maior T1 (taurina, Tabela 4.1) e o valor do tempo

de espera utilizado nas medidas foi definido como 10 segundos, aproximadamente 3 vezes o valor do maior T1. A Figura 4.2 mostra

as intensidades dos sinais obtidas nos diferentes valores de tempo de recupera¸c˜ao para os picos de taurina, creatina e lactato.

Figura 4.1: Sequˆencia de pulsos utilizada no experimento de invers˜ao-recupera¸c˜ao para determina¸c˜ao do T1.

Figura 4.2: Intensidades dos picos de creatina, taurina e lactato em fun¸c˜ao do tempo de recupera¸c˜ao τ .

4.3.2

Espectroscopia de alta resolu¸c˜ao de

_H

As medidas de espectroscopia por RMN de 1_{H foram realizadas `a}

temperatura ambiente (aproximadamente 22◦

Metab´olito Frequˆencia (ppm) T1 ± Incerteza Creatina 3, 03 2, 44 ± 0, 09

Taurina 3, 42 2, 82 ± 0, 19 Lactato 1, 30 1, 94 ± 0, 06

Tabela 4.1: Valores de T1 observados para cada um dos picos selecionados.