OBJETIVOS Geral:

Identificar microrganismos não fermentadores pouco frequentes, isolados em amostras clínicas de pacientes com FC e pacientes internados no HC-Unicamp, por técnicas fenotípicas, de espectrometria de massas e biologia molecular.

Específicos:

 Testar a técnica de PCR para identificação de Ochrobactrum anthropi,

Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa e comparar

com a identificação por provas bioquímicas manuais, automatizada pelo Vitek®_{2, Phoenix™ e por dois equipamentos de MALDI-TOF: VITEK MS da}

BioMérieux® _{(MALDI MS) e MALDI-TOF BioTyper™ da Becton & Dickson.}

 Testar e comparar a identificação de Chryseobacterium indologenes,

Elizabethkingia meningoseptica, e Cupriavidus pauculus, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa

por provas bioquímicas manuais, por automação Vitek®_{2 e Phoenix™, por}

espectrometria de massas: VITEK MS da BioMérieux® _{(MALDI MS) e}

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3. MÉTODO

3.1. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA

Este trabalho foi submetido à Comissão de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp e aprovado CAAE/Plataforma Brasil 30814914.3.0000.5404. Foram respeitadas as condições éticas pertinentes ao protocolo e seguidos rigorosamente os princípios enunciados na Declaração de Helsink II de 20/08/1947 e da Resolução 196/96 da CONEP.

Este projeto é de natureza laboratorial e foi realizado com material clínico encaminhado pelos médicos dos ambulatórios, enfermarias e UTIs do HC da UNICAMP ao Laboratório de Microbiologia do HC UNICAMP para rotina diagnóstica. Não houve participação de grupos vulneráveis ou voluntários.

Como neste trabalho não existe contato direto com os pacientes, ou grupos vulneráveis e os exames laboratoriais serão solicitados por iniciativa do médico que os atende, solicitamos dispensa do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), por ele não ser aplicável a este tipo de estudo. Foram processadas apenas amostras isoladas de material clínico dos pacientes e a identificação do material no banco de dados foram apenas pelas iniciais e pelo número do registro no Hospital de Clínicas da Unicamp (HC). No processamento dos dados e futura publicação o paciente deverá ser identificado apenas como um número interno do trabalho, garantindo a preservação de sua identidade. Além disso, o pesquisador garante que apenas ele e o orientador do trabalho

22 terão conhecimento da identidade dos pacientes, e que de forma alguma o paciente poderá ser identificado em material a ser publicado.

3.2. DESENHO DO ESTUDO

O desenho deste estudo se classifica como retrospectivo, transversal, comparativo, qualitativo e quantitativo.

3.3. CRITÉRIOS PARA SELEÇÃO DOS GENEROS ESTUDADOS

O propósito foi analisar bactérias não fermentadoras pouco frequentes, isoladas em infecções oportunistas, cuja identificação apresenta dificuldades técnicas na rotina laboratorial. Para conhecermos a incidência de bactérias não fermentadoras no Laboratório de Microbiologia do HC da Unicamp (LM), foi realizado um levantamento nos bancos de dados de hemoculturas entre 2007 e 2012. As bactérias mais comumente isoladas foram Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas

maltophilia, complexo B. cepacia, Achromobacter sp.. Pseudomonas sp..(20). Foram

escolhidos 5 gêneros cujo isolamento foi igual ou inferior a 0,5%: Chryseobacterium sp.,

Elizabethkingia sp., Ochrobactrum sp., Ralstonia sp. e Cupriavidus sp. Com base na

identificação de rotina do LM estas bactérias foram classificadas em 7 diferentes espécies: Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, Cupriavidus pauculus.

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3.4. ISOLADOS ESTUDADOS

As bactérias em estudo foram obtidas do banco de Bactérias do Laboratório de Microbiologia do Hospital de Clínicas da UNICAMP, provenientes de hemoculturas de pacientes internados, de amostras respiratórias de portadores de fibrose cística e amostras denominadas de “pesquisa” provenientes do ambiente, no período de Janeiro de 2008 a junho de 2013.

Foram detectados 80 isolados, previamente identificados por métodos fenotípicos (provas bioquímicas manuais e/ou automação pelo VITEK II) como

Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica, Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, Cupriavidus pauculus

que foram semeados em Agar Sangue (AS) para verificar viabilidade da amostra. Nesta etapa, quatro isolados foram descartados por falta de crescimento.

Após verificar crescimento, foi realizado isolamento e cinco amostras que apresentavam contaminação, foram excluídas, resultando em 71 isolados que foram armazenadas em 3 cópias para garantir a sequência do estudo.

3.5. ARMAZENAMENTO DOS ISOLADOS

Os isolados foram armazenados em meio BHI-glicerol 15% e estocados no freezer a -80ºC. A identificação foi realizada com um número interno da pesquisa (1 a 71), origem do material (hemocultura ou oriunda de trato respiratório de pacientes com FC), número de registro no HC e data do isolamento microbiológico no material clinico.

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3.6. IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA

Os isolados guardados no freezer -80ºC, foram descongelados e semeados com uma alça calibrada descartável e estéril de 10µL em caldo BHI e incubados por um período de 24 horas em estufa bacteriológica à temperatura de 35ºC ±1ºC.

A seguir, os isolados foram semeados por método de esgotamento em AS no interior de uma capela de fluxo laminar com auxílio de alça calibrada descartável e estéril de 10µL e incubados em estufa bacteriológica à temperatura de 35ºC ±1ºC por período de 24-48 horas.

As bactérias Chryseobacterium indologenes, Elizabethkingia meningoseptica,

Ochrobactrum anthropi, Ralstonia pickettii, Ralstonia mannitolilytica, Ralstonia insidiosa, Cupriavidus pauculus foram submetidas aos métodos de identificação:

1. Fenotípicos:

1.1. por provas bioquímicas manuais padronizadas pelo Laboratório de Microbiologia do HC Unicamp.

1.2. pelo sistema automatizado, Vitek®_{2 Compact (bioMeriéux}® _{Vitek Inc.,}

St. Louis, MO), para bactérias não fermentadoras.

1.3. Sistema automatizado Phoenix™ BD. 2. Por espectrometria de massas:

2.1. Identificação por MALDI TOF: VITEK MS da BioMérieux® _(MALDI

MS) que utiliza um equipamento SHIMADZU e

2.2. MALDI-TOF BioTyper™ (Bruker Daltonics) da BD®_[Becton,

Dickinson and Company] (MALDI BD). 3. Biologia Molecular

25 3.1. PCR.