Perdas gestacionais 1 Morte embrionária

Apesar dos consideráveis avanços na reprodução equina durante os últimos 20 anos, a morte embrionária permanece pouco compreendida e representa uma importante causa de perdas econômicas na criação de cavalos (Morris e Allen, 2002).

A morte embrionária em éguas é definida, apesar de não haver um consenso na literatura, como a perda gestacional que ocorre da fertilização até os 40 dias de gestação, o que corresponde ao momento de transição do estágio embrionário para o estágio fetal de desenvolvimento do concepto (Ginther, 1992). A perda gestacional que ocorre a partir dos 40 dias é definida então como morte fetal ou aborto. O diagnóstico de perda embrionária e o reconhecimento dos fatores que contribuem para sua ocorrência tomaram grande impulso com o uso da ultrassonografia. Utilizando-se a palpação transretal, as incidências estimadas de morte embrionária e perda fetal em éguas situavam-se entre 7% e 16% (Bain, 1969; Merkt e Gunzel, 1979). Através de exame ultrasonográfico, realizado entre 11 e 50 dias de gestação, variou entre 5% e 24% (Chevalier e Palmer, 1982; Ginther et al., 1985; Woods et al., 1987).

O diagnóstico de MEP é feito por palpação transretal e exames ultrassonográficos seriados, quando verifica-se a ausência da vesícula embrionária, após, pelo menos, uma identificação positiva, ou, em alguns casos, quando observam-se alterações da morfologia da mesma, tais como redução do seu diâmetro, irregularidades do contorno e ausência de batimentos cardíacos do

embrião a partir de 25 dias (Chevalier e Palmer, 1982; Ginther et al., 1985). Outros indicativos são a presença de líquido uterino, a movimentação prolongada da vesícula e o crescimento lento da mesma. Morte embrionária antes de 20 dias de gestação pode ocorrer sem que essas anormalidades sejam observadas (Ginther et al., 1985). O diagnóstico ultrassonográfico é realizado geralmente a partir dos 11 dias de gestação. Para o estudo das perdas no período anterior a 11 dias, utilizam-se técnicas de reprodução assistida como a transferência de embriões, transferência de oócitos e o cultivo embrionário in vitro (Ball et al., 1987). Vários estudos têm mostrado que a incidência de morte embrionária em éguas situa-se entre 5 a 30%. Vários fatores são apontados como responsáveis pela ocorrência da MEP, como gestação gemelar (Bergfelt et al., 1992; Ball, 1993); nutrição (Belonge et al., 1975; van Niekerk e Morgenthal, 1982); ingestão de plantas estrogênicas e efeito do fotoperíodo (Swerczek, 1980); uso de monta natural ou inseminação artificial (Moberg, 1975); lactação e “cio do potro” (Merkt e Gunzel., 1979); endometrites e outras infecções do sistema genital (Day, 1940; Kenney, 1978; Merkt et al., 1979); anormalidades cromossômicas e deficiências hormonais (van Niekerk e Morgenthal, 1982); hormônios esteroides (Villahoz, 1985); falha no reconhecimento materno da gestação e secreção insuficiente de eCG (Allen, 1984; Boeta e Zarco, 2005; Acosta, 2008); fatores imunológicos (Liu e Shivers, 1982); e ainda uma alta incidência relacionada à individualidade do garanhão (Platt, 1973). Nishikawa (1959) e Vanderwall (2011) estimaram entre 7 e 15% a incidência de morte embrionária, considerando-se, neste caso, as perdas ocorridas até os 100 dias de gestação. Von Lepel (1975) observou uma taxa de perda embrionária de 8,9% na Alemanha Ocidental.

Estudo conduzido por Villahoz et al. (1985) avaliou 356 éguas gestantes até o dia 50 da gestação, em duas estações de monta consecutivas. Observaram uma ocorrência de 17,3% de morte embrionária, sendo 77,1% antes dos 35 dias de gestação. No período de 15 a 35 dias houve maior incidência de morte embrionária entre os 15 e 20 dias (26,2%) e entre 30 e 35 dias (29,5%).

A incidência real de morte embrionária antes dos seis dias de gestação é desconhecida. Ball et al. (1986) sugeriram que a maior parte de MEP em éguas inférteis ocorre na tuba uterina, sendo que alguns estudos confirmaram que de 5 a 30% dos oócitos fertilizados resultam em embriões que morrem na tuba (Ball et al., 1987; Carnevale e Ginther, 1995).

Papa et al. (1998) ao acompanharem a gestação de 128 éguas Puro Sangue Inglês e Quarto de Milha, com o intuito de investigar a ocorrência de MEP, observaram uma taxa de perda de 13,3%. Concluíram que o principal fator envolvido seria algum grau de comprometimento do endométrio (endometrite), afastando a possibilidade de deficiência hormonal.

Tem sido observada uma alta taxa de morte embrionária quando de inseminações realizadas em períodos acima de 12 ou 18 horas pós-ovulação (Koskinen et al., 1990). Os fatores que podem contribuir para a ocorrência de perdas gestacionais na égua foram classificados como intrínsecos, extrínsecos e embrionários. Fatores intrínsecos incluem doença endometrial, deficiência de progesterona, idade materna, categoria reprodutiva da égua, e o momento da inseminação/cobertura em relação à ovulação. Os fatores extrínsecos incluem estresse, nutrição, estação/clima, individualidade do garanhão e/ou processamento e manipulação do sêmen, bem como a manipulação para técnicas de reprodução assistida. Finalmente, os fatores embrionários estão relacionados com

anormalidades cromossômicas e outras características inerentes ao embrião (Ball, 1988).

3.4.1.1. Fatores intrínsecos à morte embrionária

3.4.1.1.1. Doença uterina

Infecções uterinas são consideradas importantes causas de perda embrionária em éguas (Hughes e Loy, 1975) e baixas taxas de concepção (Watson, 2000). Devido à natureza multifatorial desse processo, recentemente, foi proposta sua subdivisão em quatro categorias, baseando-se na sua etiologia e fisiopatologia, sendo elas: (1) endometrose (endometrite crônica degenerativa), (2) doenças sexualmente transmissíveis, (3) endometrite persistente pós cobertura (EPPC), e (4) endometrite infecciosa crônica (Troedsson, 1999 e Watson, 2000). Éguas com histórico de endometrite apresentam taxas de perda embrionária superiores àquelas que não possuem esse histórico (Woods et al., 1987). Após a cópula ocorre uma inflamação transitória fisiológica no útero equino (Hughes e Loy, 1969; Kotilainen et al., 1994; Katila, 1995). O processo inflamatório é importante para remover espermatozoides mortos, plasma seminal e contaminantes uterinos antes que o embrião chegue ao útero, aproximadamente cinco dias após a ovulação. Em resposta ao sêmen, neutrófilos, imunoglobulinas e proteínas do sistema complemento migram para o útero, observando-se uma resposta máxima dentro de 8 a 12 horas após a cobrição (Katila, 1995).

As éguas que removem os contaminantes do útero diminuindo a endometrite pós- cobrição dentro de 24 a 48 horas são consideradas resistentes. Em contraste, as éguas susceptíveis são incapazes de remover

completamente os contaminantes do útero em tempo hábil, tendo por isso, altas taxas de mortalidade embrionária e baixas taxas de concepção (Mattos et al., 1999).

Éguas que apresentam falhas nos mecanismos de limpeza da resposta inflamatória uterina pós cobrição desenvolvem endometrite persistente, que resulta em problemas de fertilidade (LeBlanc et al., 1998; Zent et al., 1999). A inflamação que persiste além de 36 horas, gera acúmulo de líquido intrauterino, tornando o útero um ambiente inóspito para o embrião no momento em que o mesmo o adentra, no quinto dia pós-ovulação, e quando o corpo lúteo se torna sensível à ação da prostaglandina F2α (Adams et al., 1987). Além disso, o fluido patológico pode afetar a fertilidade através do prejuízo à motilidade e viabilidade espermática (Squires et al., 1989; Troedsson et al., 1998). Éguas que apresentam resposta inflamatória aguda associada à retenção de líquido intrauterino durante o diestro têm maiores chances de sofrer perda embrionária (Adams et al., 1987; Carnevale e Ginther, 1992).

Um fator importante para a limpeza uterina é a posição do útero dentro da cavidade abdominal da égua. Com o aumento da idade e do número de partos, o útero adquire posição mais cranioventral no abdômen. Isto é incrementado pela perda do suporte estrutural caudal do sistema genital e pelo estiramento do ligamento largo. O menor padrão de propagação e da intensidade da contração miometrial leva ao esvaziamento uterino insuficiente (LeBlanc et al., 1998; LeBlanc, 2003).

Ginther et al. (1985) observaram uma associação entre endometrite e perda embrionária entre os dias 11 e 15 pós- ovulação, em 18,2% das éguas pôneis estudadas. Os autores concluíram que essas perdas ocorreram provavelmente devido à luteólise prematura associada à endometrite, corroborando com os achados de Woods et

al. (1987), que diagnosticaram endometrite em 60% das éguas que apresentaram morte embrionária.

Papa et al. (1998) avaliaram 17 éguas que sofreram perda embrionária. A maioria delas apresentava comprometimento endometrial, sendo que nove apresentavam inflamação aguda ou crônica do endométrio, duas com fibrose periglandular e seis uma combinação de ambos os processos patológicos. Os autores concluíram, portanto, que o processo inflamatório endometrial é a maior causa de morte embrionária na espécie equina. Neste mesmo estudo, avaliou-se também o diâmetro das vesículas embrionárias, percebendo-se que as mesmas eram menores aos 16 dias pós-ovulação nas éguas que apresentaram morte embrionária, quando comparadas com as demais. Os mesmos resultados foram demonstrados por Ginther (1979).

A endometrite crônica é caracterizada pela presença de linfócitos em determinadas áreas do estroma endometrial. Pode se desenvolver em resposta à qualquer alteração endometrial, como no caso de uma gestação ou a partir de uma endometrite infecciosa, por exemplo (Vanderwall e Newcombe, 2007).

Segundo Ball et al. (1987), as endometrites crônicas parecem não causar morte embrionária, já que éguas apresentando inflamações crônicas foram capazes de manter odesenvolvimento embrionárioinicial. Neste estudo, blastocistos morfologicamente normais foram transferidos para o útero de éguas jovens, com alterações endometriais mínimas, ou para o útero de éguas mais velhas, com extensas alterações patológicas. Não foram demonstradas diferenças quanto às taxas de sobrevivência e de perda embrionária entre os dois grupos experimentais. Dessa forma, os resultados indicaram que anormalidades uterinas presentes em éguas idosas, como a fibrose periglandular e endometrites crônicas, não resultam em aumento das perdas

embrionárias. Carnevale e Ginther (1995) apontam a qualidade do oócito como o principal fator relacionado à maior taxa de perda embrionária nas éguas mais velhas, como tem sido demonstrado em trabalhos envolvendo a recuperação e transferência de embriões (Ball et al., 1987; Carnevale e Ginther, 1995; Vanderwall e Newcombe, 2007).

A dilatação cística é uma alteração endometrial não inflamatória de origem glandular ou linfática, com maior incidência em éguas mais velhas, o que é um fator potencialmente conflitante quando se estuda o efeito dos cistos na fertilidade. Grandes cistos (acima de 3,0 cm) podem atrapalhar a mobilidade do concepto, impedindo-o de sinalizar adequadamente a sua presença, de forma a inibir a secreção de prostaglandina F2α. Como consequência, pode ocorrer regressão prematura do corpo lúteo e subsequente morte embrionária (McDowell et al., 1988). Além disso, a fixação do concepto em contato direto com o cisto pode impedir o suprimento adequado de nutrientes, gerando uma circulação placentária insuficiente, capaz de levar à uma morte embrionária (Vanderwall e Newcombe, 2007).

Vários estudos têm descrito os efeitos adversos dos cistos na fertilidade (Adams et al., 1987; Chevalier-Clement, 1989), incluindo a redução das taxas de concepção e aumento das perdas gestacionais. Entretanto, quando a idade das éguas foi contabilizada na análise dos dados, não houve evidências do efeito dos cistos endometriais na taxa de perdas embrionárias em éguas (Eilts et al., 1995).

3.4.1.1.2. Deficiência de progesterona

Embora não existam informações sobre as concentrações ideais de progesterona necessárias para o desenvolvimento e manutenção de uma gestação normal,

concentrações inadequadas têm sido associadas à morte embrionária (Douglas et al., 1985; Ginther et al., 1985). Nesse sentido, Douglas et al. (1985) propuseram que níveis de progesterona abaixo de 2,5 ng/ml em torno do 12° dia indicam insuficiência lútea e inviabilidade da gestação.

No que se refere aos estrógenos, a concentração plasmática entre o 13° e o 21° dia pós- ovulação é menor em éguas com perdas embrionárias do que em éguas gestantes (Lopes et al., 1993). Isto pode ser um indicativo de viabilidade embrionária, porém são necessários estudos mais detalhados para que isso seja confirmado (Papa et al., 1998).

A reduzida produção de progesterona pelo corpo lúteo é apontada como causa importante de morte embrionária, podendo ser provocada por vários mecanismos, valendo salientar a insuficiência lútea primária; reduzido aporte gonadotrófico ao corpo lúteo; falha no reconhecimento materno da gestação; luteólise pela liberação de prostaglandina F2α pós-endometrite ou como resultado de endotoxemia; e inibição da função ovariana associada ao estresse (Bergfelt et al., 1992; Ball, 1993).

Apesar de ter sido responsabilizada como causa de perda embrionária, não há evidências de que a insuficiência lútea possa causar morte embrionária durante os primeiros 20 dias da gestação. Neste período pode ocorrer luteólise prematura induzida por endometrite, com liberação de prostaglandina F2α, o que ocasiona o encurtamento do diestro. Esta é uma das causas mais comuns de perda gestacional antes do 20o dia da gestação (Ball, 1993). Entretanto, menores concentrações séricas de progesterona foram encontradas entre os dias 7 e 11 pós-ovulação, em éguas que apresentaram perda embrionária. No entanto, não se pôde correlacionar o evento à insuficiência lútea primária, uma vez que concentrações menores de progesterona no

dia 7 pós-ovulação podem estar associadas tanto à insuficiência lútea como à luteólise precoce (Ginther et al., 1985).

Entre os 14 e 18 dias de gestação, uma falha no reconhecimento materno da gestação tem sido apontada como uma importante causa de morte embrionária. Assim, uma assincronia “materno-embrionária”, que pode ser causada por um desenvolvimento lento do embrião; secreção prematura de PGF2α uterina devido à endometrite; bem como alterações na mobilidade embrionária causadas por aderências ou cistos endometriais (Ball, 1993), podem impedir a correta sinalização do concepto, gerando sua morte.

Embora baixas concentrações deprogesterona causadas por insuficiência lútea primária tenham sido responsabilizadas como causadoras de perda embrionária em éguas, sua ocorrência não foi claramente demonstrada (Allen, 2001). Entretanto, tem sido observado que algumas éguas gestantes sofrem luteólise nos dias 14 a 16, mesmo na presença de um embrião (Ginther, 1985; Vanderwall et al., 2000). Nestes casos, observa-se edema endometrial principalmente no corpo uterino, presença da vesícula embrionária mais frequentemente no corpo do útero e menos nos cornos, e expressão de sinais de estro pela égua. Mensurações de progesterona abaixo de 1 ng/ml confirmam o quadro. Tal condição tem sido observada, principalmente, em éguas que concebem no período pós parto imediato (Ginther, 1985; Newcombe, 2000; Vanderwall et al., 2000). A suplementação com progesterona exógena pode prevenir a perda embrionária, embora o tratamento deva se estender até que ocorra a formação dos corpos lúteos acessórios e/ou que se inicie a produção de progestágenos, pela unidade fetoplacentária (Vanderwall, 2008). Apesar de não haver evidências científicas que comprovem a sua eficácia, a administração profilática de progesterona exógena tem sido utilizada na tentativa de

garantir a manutenção da gestação, especialmente, em éguas com histórico de perda embrionária. A utilização do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), administrado nos dias 10 ou 11 da gestação foi associada com a redução da taxa de perda embrionária, antes do 30° dia da gestação, o que pode estar relacionado à um efeito benéfico do aumento das concentrações endógenas de progesterona (Pycock e Newcombe, 1996; Newcombe et al., 2001).

No Brasil, Papa et al. (1998) registraram 13,8% de morte embrionária até os 30 dias pós-ovulação em 128 éguas das raças PSI e Quarto de Milha. Ao contrário do observado por Ginther et al. (1985), a disfunção lútea primária não pareceu ser a causa de morte embrionária neste estudo, uma vez que as concentrações plasmáticas de progesterona foram similares (p>0,05) entre éguas gestantes e aquelas que apresentaram perda embrionária.

Ao mensurarem as concentrações de progesterona, Darenius et al. (1987), não observaram insuficiência lútea primária em nenhuma das 14 éguas que apresentaram morte embrionária ou aborto, como foi demonstrado por Ginther (1985). Somente um animal, que sofreu reabsorção embrionária duas vezes, apresentou padrão diferenciado de progesterona. Entretanto, observou-se que esta égua não desenvolveu uma gestação normal, apresentando intervalos interovulatórios irregulares, com a demonstração de cio e ovulações, mesmo na presença de um concepto.

3.4.1.1.3. Idade materna

As maiores taxas de perda embrionária, variando de 20 a 30% ou mais, têm sido registradas em éguas com idade superior a 18 anos (Woods et al., 1987; Vanderwall et al., 1989; Carnevale e Ginther, 1992;

Hemberg et al., 2004; Carnevale et al., 2005; Allen et al., 2007).

Apesar das perdas fetais aumentarem em éguas velhas ao final da gestação, as perdas precoces são as principais responsáveis pela reduzida fertilidade observada. As taxas de fertilização aproximam-se dos 90% e não sofrem grande interferência da idade, sendo de 91-96% para éguas jovens e de 81-92% para éguas velhas (Ball et al., 1986; Ginther, 1992). Por outro lado, as perdas gestacionais entre 15 e 42 dias foram muito superiores nas éguas de idade avançada quando comparadas com éguas jovens (23% e 5%, respectivamente) (Morris e Allen, 2002; Allen et al., 2007).

Mesmo com alta taxa de fertilização, as taxas de coleta de embriões nos dias 6 e 9 pós- ovulação são significativamente maiores para éguas mais jovens quando comparadas com éguas de idade avançada, o que implica em alta taxa de perda embrionária durante a primeira semana de gestação nestas éguas (Woods et al., 1986; Vogelsang e Vogelsang, 1989). Dessa forma, estimativas do percentual de perdas embrionárias entre a fertilização e o 10° de gestação, estão em torno de 9% para éguas jovens e 60-70% para éguas velhas (Ball et al., 1986, 1989).

Possíveis causas de perdas embrionárias em éguas de idade avançada incluem: anormalidades do ambiente uterino, falhas no transporte dos gametas, envelhecimento do oócito, alterações na tuba uterina e defeitos embrionários. Deformidades do sistema genital, que facilitam o acesso de contaminantes para o interior do útero, também contribuem para menores taxas de concepção (Ginther, 1992).

Clinicamente, anormalidades do endométrio têm sido consideradas um importante fator envolvido na reduzida fertilidade de éguas mais velhas. Um grande número de estudos tem caracterizado alterações degenerativas do endométrio em função do aumento da idade da égua, sendo que o declínio da

fertilidade associado com o avançar da idade tem sido frequentemente atribuído a estas alterações, que incluem endometroses, endometrites bem como alterações vasculares (Ball, 2000). Éguas com idade superior a 15 anos apresentaram maior incidência de alterações uterinas inflamatórias e degenerativas, associadas a uma menor contratilidade uterina em relação às éguas jovens (Carnevale et al., 1993b). Segundo Carnevale e Ginther (1992), a contratilidade uterina insuficiente poderia resultar em redução da mobilidade do embrião, um contato insuficiente do mesmo com o endométrio, e consequentemente luteólise e perda embrionária.

As angiopatias em éguas reprodutoras estão relacionadas com o número de partos e com o avançar da idade (LeBlanc, 2003). Portanto, éguas mais velhas e com elevado número de partos apresentam aumento de alterações inflamatórias degenerativas no sistema vascular uterino, com angioesclerose ou ainda a esclerose da prenhez, caracterizada pelo aumento da ruptura da membrana elástica interna, atrofia medial e da íntima, elastose adventicial e calcificação medial da parede dos vasos (LeBlanc et al., 1998). Além disso, Henry (1981) demonstrou alta frequência de aderências infundibulares e infundibulites em éguas mais velhas. Desta forma, percebe-se que o sistema reprodutivo das éguas se torna, com o avançar da idade, cada vez mais inóspito para receber e manter o desenvolvimento de um embrião.

Assim, Morris e Allen (2002) detectaram menores taxas de perda gestacional em éguas com idades entre 3 e 8 anos, sendo que a taxa quase duplicou em éguas apresentando de 9 a 13 anos de idade. Segundo os autores, isso é resultante do início das alterações degenerativas endometriais inerentes à idade, reduzindo sua capacidade nutritiva para o concepto em desenvolvimento (Bracher et al., 1996).

A coleta de embriões na tuba uterina no quarto dia após a fertilização em éguas jovens e mais velhas, com posterior transferência dos mesmos para o útero de éguas jovens, foi avaliada. Observou-se, neste experimento, que as taxas de sobrevivência embrionária, dos embriões oriundos dos animais mais novos, foram significativamente superiores em relação ao que observou-se naqueles oriundos de éguas mais velhas (84% e 25%, respectivamente). Assim, segundo os autores, os efeitos deletérios da idade da égua sobre a fertilidade devem ser atribuídos, principalmente, a defeitos intrínsecos ao oócito e ao embrião resultante (Ball et al., 1989).

Ao investigarem a qualidade do oócito de éguas mais velhas, Carnevale e Ginther (1995) realizaram aspirações foliculares e transferência de oócitos para comparar a sua viabilidade e a de embriões de éguas com idades entre 6 a 10 anos, e entre 20 e 26 anos. Os oócitos aspirados foram transferidos para a tuba uterina de receptoras jovens, de forma a se evitar o contato dos mesmos com o ambiente tubárico potencialmente deletério das éguas mais velhas. No 12° dia após a fertilização, detectou-se taxa de concepção de 92% para os oócitos coletados de éguas jovens, e 31% para os oriundos de éguas mais velhas, novamente demonstrando-se a influência da idade sobre a qualidade do gameta feminino. Carnevale et al. (1999) utilizando microscopia eletrônica comparou oócitos de éguas jovens e éguas velhas. Observaram que a maioria dos oócitos oriundos dos animais mais velhos apresentava grande quantidade de vesículas intracelulares. Além disso, perceberam que os oócitos dessas fêmeas possuiam anomalias morfológicas não visualizadas nos oócitos das éguas jovens, como grandes vesículas no ooplasma ou associadas ao núcleo, regiões do