Procedimentos experimentais

Amostras de solo foram coletadas de cada parcela experimental antes e após o plantio, totalizando 20 amostras de solo. O solo foi seco em estufa, com temperatura média de 60 a 65°C por 48 h, e após moído com almofariz e pistilo e passado em peneira 0,0063mm. A seguir foram determinadas as frações total e solúvel de Pb, As e Zn e a fração biodisponível extraída para análise de Pb e Zn pelo método DPTA (Raij et al. 2001).

4.5.1.1 Concentração total de Pb, As e Zn

Foram colocados 500 mg de solo em tubos de digestão juntamente com 10 mL de HNO3 (10%). Após 15 min de repouso, o extrato foi colocado no microondas (950

W) por 10 min. Após o esfriamento dos tubos, realizou-se a filtragem do extrato com três lavagens sucessivas com água deionizada e os extratos foram avolumados para 50 mL (Raij et al. 2001). Nestes foram determinados os teores totais de Pb, As e Zn, por espectrometria de emissão ótica induzida em plasma (ICP-OES, Varian, Vista MPX, PAlo Alto, CA, USA). Solo certificado Nist:Montana II 2711 foi utilizado como padrão analítico e de controle das análises por ICP.

4.5.1.2 Concentração biodisponível de Pb e Zn (método DTPA)

Foram pesados 10 cm³ de cada repetição de solo. Após pesagem, as amostras de solo receberam 20 mL de solução extratora contendo ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) 0,005 mol L-1, CaCl2 0,01 mol L-1 e trietanolamina 0,1 mol L-1, ajustada a pH

7,3. A seguir, agitou-se as amostras por 2 horas a 220 rpm. Os extratos foram filtrados em filtro faixa azul durante a noite (filtragem lenta), para determinação dos teores biodisponíveis de Pb, As e Zn (Raij et al. 2001) por ICP-OES. Em virtude dos limites de detecção do equipamento não foi determinada a concentração do As.

4.5.1.3 Concentração solúvel de Pb, As e Zn

Foram adicionadas 500 mg de solo em tubos de digestão juntamente com 10 mL de água. Após 15 min de repouso, a amostra foi colocada no carrossel e introduzida no micro-ondas (950 W) por 10 min. Após o resfriamento dos tubos, realizando a filtragem do extrato com três lavagens sucessivas com água deionizada, os extratos foram avolumados em balão de 50 mL, identificados e levados para determinação dos teores de Pb, As e Zn ( Raij et al. 2001) por ICP-OES.

4.5.2 Variáveis analisadas na planta

Foram analisados diversos parâmetros da planta com objetivo compreender o tolerância e desenvolvimento da mesma na presença das concentrações baixas e altas de Pb, As e Zn no solo. Na coleta da planta, as folhas foram destacadas e acondicionadas em sacos de papel separando somente as folhas unifoliares para análise da área foliar. Caules e raízes foram extensivamente lavadas em água de torneira e acondicionadas em estufa para o processo de secagem.

As variáveis analisadas na planta correspondem às características químicas e de crescimento e desenvolvimento destas. As análises químicas foram realizadas no IAC- Campinas e aquelas relativas ao crescimento e desenvolvimento das plantas foram realizadas no DBV do IB da Unicamp.

4.5.2.1 Concentração elementar na parte aérea e raízes de C. ensiformis

Uma quantidade de 500 mg de material vegetal (parte aérea e raiz) foi finamente moída e colocada em tubos de digestão juntamente com 2 mL de H2O2 (30%, v/v). Após

24 h foram adicionados 3 mL de HNO3 (65%) e após 40 min de descanso os tubos

foram levados para digestão no microondas (950 W) por 30 min. Após o esfriamento dos tubos, os extratos foram filtrados e avolumados a 25 mL e neles determinadas as concentrações de P, Ca, Mg, S, Fe, Mn, Mo, Ni, B, Cu, Ba, Se, Pb, Zn e As por ICP- OES (Varian Vista MPX), conforme Raij et al. (2001).

4.5.2.2 Produção de biomassa: massa da matéria fresca e seca

Após a coleta da planta foi determinada a massa da matéria fresca de folhas, caules e raízes, por pesagem. Raízes, folhas e caules foram acondicionados separadamente em sacos de papel e secos em estufa com circulação forçada de ar a 60°C até massa constante, momento no qual foram pesadas e determinada a massa da matéria seca. A parte aérea e raízes foram moídas separadamente em moinho de facas para posterior determinação da concentração de Pb, As e Zn após digestão com ácido nítrico (método EPA-3051, conforme descrito em Raij et al. 2001).

4.5.2.3 Determinação da peroxidação de lipídios, aminoácidos livres e prolina nas folhas

A peroxidação de lipídeos foi avaliada através da determinação do conteúdo de malondialdeído (MDA), conforme Cakmak & Horst (1991). Após a homegenização de 0,250 g de tecido foliar, este foi liofilizado com ácido tricloroacético (TCA) a 0,1% e

centrifugado a 10.000 xg por 10 min. A seguir, foi adicionado 2 mL de ácido tiobarbitúrico 0.5% em TCA 20% a 0,5 mL do sobrenadante. A mistura foi incubada por 30 min em banho-maria a 95°C e resfriada em banho de gelo. Após esse tempo as amostras foram centrifugadas a 10.000 xg por 10 min. A absorbância dos extratos foi medida por espectrofotometria nos comprimentos de onda 532 e 600 nm. A concentração de MDA foi calculada utilizando um coeficiente de extinção de 155 mmol-

1

cm-1.

Para extração de aminoácidos livres totais e de prolina 50 mg de tecido foliar liofilizado foram colocados em solução metanol-clorofórmio-água - MCW (12:5:3, v/v/v) por uma semana a 4ºC (Bielesk & Turner 1966). Em seguida adicionou-se quantidade definidas de clorofórmio e H2O e o extrato foi deixado em repouso por 1 dia

a 4ºC. A fase superior metanólica/aquosa formada foi retirada e seca em Speed Vac (Savant). Após secagem a fração foi dissolvida em água e utilizada nas diferentes análises. A quantificação de aminoácidos livres e de prolina no tecido foliar foi realizada por espectrofotometria UV-vis (Bates & Waldren 1973, Bieleski & Turner 1966)

4.5.2.4 Avaliação da nodulação e colonização micorrizica das raízes

O número de nódulos formados nas raízes foi determinado por contagem (Figura 7 A e B).

Figura 7: Procedimentos de coleta de raízes (A) e separação e contagem (B) dos nódulos.

Foi avaliada a capacidade da planta de formar simbiose com FMAs. Esse procedimento foi realizado por meio da avaliação da porcentagem do comprimento de raiz colonizada por FMAs, a qual foi calculada baseando-se na quantidade de estruturas típicas da simbiose (hifas intra e extrarradiculates, vesículas, arbúsculos e/ou esporos) em segmentos de raízes previamente diafanizadas e coradas em azul de tripan através dos métodos propostos por Genderman & Nicolson (1963) e Giovanetei & Mosse (1980), respectivamente. Também foram avaliados o número de esporos fúngicos pelo método de extração úmida (Gerdemann & Nicolson 1963) utilizando sacarose 40% (Jenkins 1964) (Figura 8 A, B, C e D).

Figura 8: Procedimentos de coleta de esporos por extração úmida (A), extração dos esporos do solo com solução de sacarose (B), centrifugação da solução (C) e contagem de esporos com auxilio de lupa (D).

A B

4.5.2.5 Desenvolvimento da planta 4.5.2.5.1 Altura

Foram medidas as alturas de cada planta com fita métrica semanalmente, observando a progressão das plantas de cada um dos dois tratamentos.

4.5.2.5.2 Número de folhas, área foliar e clorofila

O número de folhas foi determinado durante o experimento e anotado semanalmente. A concentração de clorofila nas primeiras folhas trifoliadas foi medida pelo clorofilómetro (CMM-200 Opti-Sciences). Posteriormente, com as folhas recém- coletadas, foi determinada a área foliar de cada planta utilizando um medidor de área foliar de bancada (Li-Cor LI 3100 Area meter).

4.5.3 Cálculo dos índices IT e BFC

O Índice de Translocação (IT) foi calculado de acordo com o método de Abichequer & Bohnem (1998) indicado para medir a quantidade translocada de Pb, As e Zn da raiz para parte aérea.

IT (%) = Concentração de Pb, As, Zn acumulada na parte aérea x 100/ Concentração de Pb, As e Zn acumulada na planta

O Fator de Bioacumulação (BCF) foi calculado de acordo com o método de Zhang et al (2012) indicado para avaliar a bioacumulação de Pb, As e Zn no tecido da planta.

BCF= concentração de Pb, As e Zn na raiz / concentração de Pb, As e Zn no solo