Procedimentos gerais

3.1.1 Animais

Os experimentos foram realizados em ratos normotensos da linhagem Wistar (WT) e Espontaneamente Hipertensos (SHRs), pesando entre 300 a 380g, provenientes do Biotério Central do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade Federal de Goiás. Os ratos foram alojados aleatoriamente em caixas (47 cm x 31 cm x 16 cm) coletivas com cinco ratos cada, tiveram livre acesso à água e a ração. As caixas foram mantidas no Biotério Setorial do ICB II em ambiente com ciclo claro/escuro de 12/12 horas e temperatura controlada.

Todos os experimentos foram realizados em animais acordados sob aprovação do Comitê de Ética e Uso de Animais (CEUA) n° 018/15. Nós realizamos todos os esforços para minimizar o número de ratos usados.

3.1.2 Drogas e reagentes utilizados

Todas as drogas foram diluídas em salina estéril (NaCl 0,9%), o veículo de escolha. O reagente e drogas testadas foram: i) o Veículo (VHE) como controle negativo em todos os testes comportamentais; ii) Bj-PRO-7a (GenOne Biotecnologia, Brasil) nas doses de 71, 213 ou 426 nmol/kg conforme estudos prévios (240, 253); iii) o benzodiazepínico Diazepam (DZP) (Medicamento genérico, Neo Química, Brasil) na dose de 2 mg/kg como controle positivo nos testes de ansiedade e locomoção/exploração; iv) o antidepressivo tricíclico Imipramina (IMI) (Torfranil®, Cloridrato de imipramina, Novartis Biociência, Brasil) na dose de 15 mg/kg (265) como controle positivo no teste de depressão; v) antagonista seletivo dos M1Rs Pirenzepina (PZP) (Sigma, St. Louis MO, USA) na concentração de 256,1 nmol/2µL/rato e na dose de 852 nmol/kg; vi) o inibidor da enzima tirosina hidroxilase α-metil-DL-tirosina (AMPT) (Sigma, St. Louis MO, USA) na dose de 200 mg/kg (266) para revelar a contribuição das catecolaminas; vii) o antagonista dopaminérgico não-específico Clorpromazina (CLP) (Sigma, St. Louis MO, USA) na dose de 2 mg/kg (267) para acessar a possível contribuição dos receptores dopaminérgicos. Os anestésicos usados foram: i) 2,2,2- Tribromoetanol (Sigma, St.

Louis MO, USA) na dose de 250 mg/kg para implantação de cânula guia (ver item 3.1.4); ii) Tiopental (Thiopentax®, Cristália) na dose de 40 mg/kg para eutanásia (ver item 3.1.6). Os reagentes e as drogas foram administradas via intraperitoneal (i.p.), exceto a Pirenzepina (256,1 nmol/2µL/rato) injetada intracerebroventricular (i.c.v.).

O antiinflamatório não-esteroidal, analgésico, antipirético e antiendotóxico (Flunixin injetável, Chemitec) na dose de 2 mg/kg injetado via intramuscular e a associação antiinfecciosa polivalente (Pentabiótico veterinário, Zoetis) na dose de 24.0000 UI/kg injetada via subcutânea usados ao final do procedimento cirúrgico (ver item 3.1.4).

3.1.3 Confecção de cânula guia e agulha injetora

A cânula-guia (CG) foi confeccionada utilizando-se agulha 25x6 mm, ajustada até o comprimento de 15 mm por eletrocorrosão. A agulha injetora foi confeccionada a partir da agulha genvival G30 e ajustada a 17 mm por eletrocorrosão. Assim, no momento da microinjeção, a extremidade da agulha injetora permaneceu 2 mm abaixo da cânula guia para atingir o ventrículo lateral.

3.1.4 Implantação de cânula guia no ventrículo lateral (vl)

Witkin e colaboradores (2014) mostraram a capacidade da Pirenzepina, antagonista dos M1Rs, em acessar o SNC (268) apesar do caráter não lipofílico. Entretanto, para nos certificar, decidimos injetar a Pirenzepina no vl e comparar os efeitos na ansiedade e locomoção/exploração com a Pirenzepina injetada i.p.

Para as cirurgias de implantação de cânula guia, ratos WT foram anestesiados com Tribromoetanol (25 mg/kg), tricotomizados e fixados ao aparelho estereotáxico (Insight Equipamentos). Em seguida, uma incisão longitudinal de 1,5 cm foi realizada na cabeça do animal com o auxílio de um bisturi para expor a calota craniana. O periósteo foi removido por raspagem e o campo cirúrgico foi limpo com iodo a 2% para prevenir infecções. Posteriormente, foi feita a trepanação craniana com auxílio de uma broca dental para inserção da cânula guia e parafusos. A cânula guia foi inserida no vl esquerdo 0,8 mm caudal ao bregma (antero-posterior), 2 mm lateral a linha média (latero-lateral) e 3,5 mm abaixo da dura-máter (dorso-ventral) (269). Os parafusos de aço inoxidável foram fixados a calota craniana para suporte

mecânico da prótese de acrílico autopolimerizável. Para evitar a obstrução da cânula guia e isolar o cérebro do meio externo até o momento da injeção, um mandril de aço inoxidável foi introduzido na cânula e posteriormente fixado a prótese com resina acrílica. Para minimizar o processo inflamatório, dor e o risco de infecções, os animais receberam Flunixin (2 mg/kg) e Pentantibiótico (24.000 UI/kg) ao final do procedimento cirúrgico. Após o período de recuperação dos animais (5 dias), os testes comportamentais de ansiedade e locomoção/exploração foram realizados. 3.1.5 Injeções no ventrículo vateral (vl)

As injeções de Pirezenpina (256,1 nmol/rato) no vl esquerdo foram feitas com seringa Hamilton (10 L) conectada por meio de um tubo de polietileno (10 mm de diâmetro) a uma agulha injetora de aço inoxidável (de acordo com o item 3.1.3). O volume injetado no vl foi de 2 L.

3.1.6 Confecção de lâminas histológicas

Ao término dos testes comportamentais, os animais foram anestesiados com Tiopental (40 mg/kg) e o corante Azul de Evans 2% foi injetado no vl esquerdo para confirmação do posicionamento da injetora. Posteriormente, o cérebro dos animais foi removido e incubado em solução de formaldeído tamponado a 10% por 48 horas. Em seguida, os cérebros foram mantidos em sacarose a 30% por no mínimo 48 horas. Os cérebros foram seccionados transversalmente no Criostato (Leica CM 1850, Alemanha) em fatias de 50 µm de espessura. As fatias foram coletadas e armazenadas em solução salina a -20 ºC até a montagem dos cortes histológicos em lâminas gelatinizadas. As lâminas foram coradas posteriormente pela técnica de Vermelho Neutro a 28%. Para confirmação do local de injeção, os cortes histológicos foram visualizados em microscópio óptico e apenas os animais com injeção no vl esquerdo foram incluídos nos resultados.

3.1.7 Pletismografia de Cauda

A Pressão Arterial Sistólica (PAS) foi mensurada por pletismografia de cauda em SHRs para confirmar a hipertensão dos animais. Após os animais atingirem 15 semanas de idade, a PAS foi mensurada por 4 dias. Em uma caixa fechada, os ratos foram pré-aquecidos a aproximadamente 38 ºC durante 15 minutos para dilatação

da artéria caudal. Em seguida, o animal foi colocado em uma caixa individual com maravalha e um manguito de borracha foi posicionado na base da cauda do animal juntamente com um receptor de pulso, ambos acoplados a um transdutor e conectados a um sistema de aquisição de dados (PowerLab 4/25, ML0380/D, ADInstruments, Bella Vista, Austrália). O pulso da artéria caudal foi mensurado 3 vezes para cada animal a partir da obstrução e desobstrução do fluxo da artéria caudal pela insuflação e desinflação do manguito, respectivamente. Os sinais da PAS foram obtidos a partir do software LabChart Pro (v.7.3.7, ADInstruments, Bella Vista, Austrália) e uma média dos valores obtidos foi realizada.