4.2. Bacteriologia
4.2.4. Procedimentos para diagnóstico bacteriológico
4.2.4.1Aparelho urogenital
Urina
A amostra a ser utilizada é a urina do jato médio. As bactérias potencialmente patogénicas colonizam a uretra, pelo que o primeiro jato de urina deve ser descartado. (76) Também pode ser analisada amostra de punção supra-púbica, tubo de algália ou saco coletor pediátrico.
Procedimento
É colocada amostra num tubo de centrifuga, e após centrifugação durante 5 minutos a 1500 rpm, é feita observação do sedimento urinário, colocando uma gota entre lâmina e lamela. A observação é feita com objetiva 40x. O exame corado pode ser realizado se solicitado.
Através de uma ansa calibrada de 1µL é realizada sementeira em gelose Cistina Lactose Deficiente em Eletrólitos (CLED), com incubação a 37ºC, 18-24h em aerobiose.
Valorização dos resultados
As infeções urinárias mais comuns são pielonefrites (infeção do parênquima renal) e cistites (infeção das vias urinárias baixas), sendo que as infeções agudas do aparelho urinário são geralmente causadas por flora saprófita que invade por via ascendente através da uretra. Vários fatores podem contribuir para a infeção das vias urinárias, nomeadamente a suscetibilidade do hospedeiro devida a diabetes, gravidez, estase ou obstrução urinária, doenças sexualmente transmissíveis, entre outros. O organismo mais comumente associado a estas infeções, é a Escherichia coli, apesar de outros microrganismos também poderem ser responsáveis, nomeadamente Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus e Enterococcus spp. (72,76)
Na valorização dos resultados, deve ter-se em conta o método pelo qual a urina foi colhida, o tipo de doente, idade, entre outros parâmetros. A observação do sedimento é muito importante, sendo que a leucocitúria constitui o principal marcador da infeção. (72)
São avaliados em vários campos a presença de eritrócitos (apenas mencionados se vistos), leucócitos e células, com os seguintes níveis:
81
0-5 Raras
5-10 Algumas
>10 Muitas
No exame cultural é feita a observação das placas e efetuada a valorização das amostras de acordo com o número de células epiteliais, de leucócitos e com a contagem de colónias:
<104UFC/ml
104 UFC/ml –105UFC/ml >105 UFC/ml
Valores superiores a 105 são sempre valorizados, valores entre 104 –105 são valorizados de acordo com o sedimento: no caso de culturas mistas, faz-se ou não o estudo das colónias, dependendo do número de leucócitos e células e do tipo de amostra. Em culturas polimicrobianas com alguns ou muitos leucócitos, aconselha-se repetição de colheita, se clinicamente justificável. No caso das crianças, o exame bacteriológico da urina pode originar resultados falsamente positivos, devido à urina colhida por saco coletor. Se necessário, pede-se nova colheita, para confirmação de resultados. No caso de placa negativa com muitos leucócitos, realiza-se coloração do sedimento por Gram para verificar a presença de bactérias, caso positivo, volta-se a semear a placa. A presença de células indica colonização/contaminação, por outro lado, a presença de leucócitos indica infeção. Qualquer desenvolvimento bacteriano em cultura pura, que não seja resultante de contaminação pela flora comensal, de amostras colhidas por punção supra-púbica, são valorizados. A estirpe valorizada é isolada em cultura pura para posterior identificação e TSA.
Exsudado vaginal Procedimento
Com a zaragatoa colocada em meio de transporte com carvão:
o É semeado gelose Columbia + 5% de sangue de carneiro (GS) – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, observação diária (OD)
o É semeado gelose Chocolate PolyViteX VCAT3 (VCA) – Incubação a 37ºC, 5% CO2, 72h, OD
82
Com a zaragatoa seca é realizado um esfregaço e este é corado por Gram.
Valorização dos resultados
Os agentes bacteriológicos mais comumente pesquisados nas secreções vaginais são Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum. Nas mulheres, estas infeções podem causar secreções mucosas e ulcerações, desconforto, dor e ardor e inserem-se em duas categorias principais: infeções por organismos patogénicos de transmissão sexual, nomeadamente Neisseria gonorrhoeae (visíveis no Gram como diplococos GN e com crescimento no VCA) e Chlamydia trachomatis (causadoras de uretrite) e infeções por microrganismos endógenos, que se tornam patogénicos devido a desequilíbrio da fora saprófita, como a vaginose provocada por Gardnerella vaginalis que se apresenta no Gram como células epiteliais com “pontinhos” e ausência de bacilos de Doderlein. (72,79)
Streptococcus agalactiae, colonizam a mucosa genito-urinária, e provocam infeções urinárias na mulher grávida e meningite no recém-nascido pelo que são valorizados em mulher em idade fértil, quando isolados da GS. (72)
No esfregaço corado por Gram valorizam-se células epiteliais (observação de muitas células significa que o esfregaço foi bem feito), bacilos de Doderlein (observados em mulheres em idade fértil) e leucócitos, segundo os níveis:
0-5 Raras
5-10 Algumas
>10 Muitas
A estirpe valorizada, em função do exame direto corado e do crescimento em cultura, é isolada para posterior identificação e TSA.
Exsudado uretral Procedimento
Com a zaragatoa colocada em meio de transporte com carvão: o É semeado VCA – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 72h, OD Com a zaragatoa seca é realizado um esfregaço e este é corado por Gram.
83 À semelhança da mulher, os agentes Neisseria gonorrhoeae (visíveis no Gram como diplococos GN e com crescimento em VCA), Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum, são responsáveis por causar infeções genitais, sendo que os dois primeiros originam a maioria dos casos de uretrite nos homens. Nos homens, a infeção pode causar secreção uretral, dor na micção e inchaço doloroso. (79)
A estirpe valorizada é isolada, identificada e é realizado o TSA.
Rastreio de Streptococcus agalactiae na gravidez
Os S.agalactiae colonizam a mucosa genito-urinária e são responsáveis por infeções graves no recém-nascido (meningite) e septicémia neonatal, pelo que a sua deteção é muito importante para a prevenção e tratamento da infeção. Grávidas colonizadas fazem antibiótico. (72,76)
A amostra a analisar consiste numa zaragatoa vaginal e numa zaragatoa retal, sem meio de transporte.
Procedimento
As duas zaragatoas são colocadas em caldo Todd-Hewitt + antibióticos (TODD) com antibióticos na estufa a 37ºC. Após 18-24h, é feita passagem para meio Granada anaerobiose e incubado a 18-24h.
Valorização dos resultados
São inspecionadas as colónias sugestivas (laranjas) no meio Granada. Se estiverem presentes, é necessário reisolamento para gelose Columbia ANC + 5% de sangue de carneiro (CNA) pois não se faz TSA do meio cromogéneo.
Teste rápido para pesquisa de Clamydia trachomatis
A Clamydia trachomatis é uma das maiores causas de infeção transmitida sexualmente. A transmissão vertical da bactéria tem complicações graves no recém- nascido, nomeadamente conjuntivite e pneumonia. A maioria das infeções na mulher são assintomáticas, mas podem ser sintomáticas e originam cervicite, endometrite e uretrite, entre outras manifestações clínicas. No homem, muitos casos de uretrite e epididimite são causados por Clamydia trachomatis e cerca de 25% das infeções no homem são assintomáticas, sendo que os pacientes assintomáticos constituem um problema para a disseminação da doença. É utilizado um dispositivo de teste rápido imunocromatográfico
84
para deteção qualitativa do antigénio da bactéria em amostras de esfregaços vaginal, uretral e urina masculina. (76,79,80)
Procedimento
A amostra é adicionada a um tubo contendo dois reagentes. No caso de ser uma zaragatoa, esta é introduzida e rodada contra a parede. São colocadas três gotas no dispositivo de teste.
O teste contem o anticorpo específico do antigénio da bactéria a revestir a região da linha de teste e partículas revestidas com o anticorpo. Durante o teste, a solução do antigénio extraído reage com as partículas e a mistura migra para reagir com o anticorpo sobre a membrana na linha de teste. Após 10 minutos é lido o resultado, que será positivo quando aparecem duas linhas coloridas, uma no controlo e outra na região da linha de teste. (80)
Teste para pesquisa de micoplasmas urogenitais
O trato genital é colonizado com espécies de Mycoplasma spp. e Ureaplasma spp. M. hominis pode causar pielonefrite, febre pós-parto e infeções sistémicas em pacientes imunocomprometidos. U. urealyticum pode causar uretrite, pielonefrite e aborto espontâneo ou parto prematuro. No entanto, a deteção de micoplasmas no trato genital não é necessariamente equivalente a infeção, devendo ser tida em conta a situação clínica do paciente. (76)
Este kit permite a identificação de Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis em amostras endocervicais e uretrais colhidas com zaragatoa, urinas e sémen e baseia-se em propriedades metabólicas especificas das espécies e resistências. No caso do U. urealyticum, testa a hidrólise da ureia e resistência à lincomicina e no M. hominis, a hidrólise da arginina e resistência à eritromicina. (81)
Procedimento
Regenera-se um meio de cultura do kit com o meio de transporte inoculado e adiciona-se esta mistura aos poços do teste que correspondem a um controlo de crescimento, identificação de U. urealyticum, identificação de M. hominis, teste de resistência à lincomicina e teste de resistência à eritromicina. É adicionada parafina aos poços e o teste é colocado na estufa a 37ºC durante pelo menos 24h. O crescimento destas
85 espécies é visualizado por mudança de cor do indicador de pH de amarelo-laranja para vermelho ou rosa (alcalino). (81)
4.2.4.2.Aparelho circulatório
Hemoculturas
Uma hemocultura corresponde a sangue colhido por punção venosa de veia periférica, para dois frascos de hemocultura, um de aerobiose e outro de anaerobiose. Procedimento
O frasco é conservado em estufa a 37ºC ou à TA até ser colocado no bacT/ALERT (permanece neste equipamento durante 5 dias), até um máximo de 2h. No caso do resultado dado pelo equipamento ser positivo, com uma agulha na tampa do frasco, são colocadas duas gotas em lâmina (corada posteriormente por Gram) e duas gotas no meio de cultura (GS), com incubação a 37ºC durante 24h. Este passo é sempre repetido ao 5º dia, caso o frasco tenha positivado antes, independentemente do resultado obtido na primeira passagem. Se for o frasco de anaerobiose que positivou, para além da GS, é semeado SCS, com incubação a 37ºC, aerobiose, 24h.
Valorização dos resultados
As doenças infeciosas podem decorrer com bacterémia transitória, intermitente (infeções localizadas) ou persistente (infeções intravasculares como endocardite). Septicémia corresponde a bacterémia acompanhada de um estado infecioso grave, condicionada por descargas massivas e repetidas de bactérias no sangue. Como o sangue é um produto biológico estéril, o isolamento de um microrganismo a partir de uma hemocultura é quase sempre valorizado. (72,76,79)
Os bacilos GN entéricos são as causas mais comuns de choque sético, apesar de poder ocorrer devido a uma gama ampla de microorganismos. Endocardite pode ocorrer devida a Streptococcus viridans, Enterococcus spp e Staphylococcus aureus, sendo que este último é o agente mais comum de miocardite e pericardite. (76,79)
O fator mais importante que determina o sucesso deste teste é o volume de sangue colhido, porque a concentração dos microrganismos é baixa na maioria das bacterémias, principalmente se o doente está a tomar antibiótico. A colheita não deve ser efetuada no pico febril e a assepsia da pele do paciente é importante, para não ocorrer contaminação com bactérias que colonizam a pele, como Staphylococcus coagulase negativos, pelo que
86
estes podem contaminar o sangue, se a hemocultura não for colhida em condições de assepsia. (72,76)
Podem ocorrer falsos positivos no aparelho, pelo que apenas se dá um resultado positivo quando se verifica também crescimento na placa e bactérias no Gram. No esfregaço corado por Gram, os Staphylococcus apresentam-se de cor roxa/azulada (são GN) e em “cacho”. Faz-se um teste da coagulase para distinguir entre Staphylococcus aureus ou Staphylococcus coagulase negativos (presentes à superfície da pele). Estes últimos apenas são valorizados se presentes nos quatro frascos de hemocultura (2 pares), caso contrário, indicam contaminação. Caso seja observada qualquer outra bactéria no esfregaço, o médico é logo notificado. A estirpe valorizada é isolada e procede-se à identificação e TSA de uma das placas.
Cateteres vasculares
Normalmente o cateter vem a acompanhar a hemocultura e pretende-se avaliar a possibilidade deste ser responsável por um quadro de bacterémia. (72)
Procedimento
O cateter é colocado na superfície de uma placa de GS e com o auxílio de uma pinça esterilizada, é rodado na superfície do meio, de modo a que a ponta passe por todo o meio de cultura. A incubação é feita a 37ºC, 48h, em aerobiose.
Valorização dos resultados
Se apenas o primeiro frasco de hemocultura (colhido antes da retirada do cateter) e o cateter estiverem positivos, significa que o cateter estava infetado.
Se o crescimento for superior a 15 colónias de apenas um tipo, é valorizado e identificado com realização de TSA. Apenas não se valorizam contaminantes da pele, como S. coagulase negativos, a não ser que as quatro hemoculturas que o acompanham sejam positivas para esta bactéria. Não se valoriza quando estão presentes mais do que dois tipos diferentes de colónias.
4.2.4.3.Aparelho digestivo
Fezes
87 A amostra é semeada nos seguintes meios:
o gelose MacConkey (MCK): incubação a 37ºC, 48h, aerobiose o gelose Hektoen (HEKT): incubação a 37ºC, 48h, aerobiose
o gelose Campylosel (CAM): incubação a 37ºC, 5 dias, microaerofilia o Caldo Selenito: Incubação a 37ºC, 18-24h, aerobiose – Após 24h de
incubação, são efetuadas subculturas do meio de selenito para HEKT (caldo Selenito é meio de enriquecimento de Salmonella)
Valorização dos resultados
Uma grande variedade de bactérias pode causar infeções gastrointestinais, que têm uma alta incidência na população em geral, principalmente em crianças e idosos. (67)
Os agentes bacteriológicos mais comuns causadores de gastroenterite são Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp., E. coli, Vibrio cholerae e Bacillus cereus. Staphylococcus aureus e Bacillus cereus são responsáveis por intoxicações alimentares. (76)
Muitas bactérias patogénicas e não patogénicas estão presentes nas fezes, pelo que os antecedentes epidemiológicos, presença de sinais e sintomas clínicos e o tipo de diarreia, são fatores que devem orientar na pesquisa do agente. Pode ocorrer diarreia aquosa devido a enterotoxinas de bactérias como Escherichia coli enterotoxigénica ou as fezes podem apresentar-se sangrentas e mucoides devido a bactérias invasivas como Shigella spp. (72,76,79)
No meio MCK são valorizadas colónias que não fermentam a lactose (incolores), que poderão ser Shigella ou Salmonella. No meio HEKT é valorizada a presença de colónias azuis esverdeadas (não fermentam os açúcares presentes no meio) e colónias com centro negro (bactérias que produzem sulfeto de hidrogénio), que identifica presuntivamente Shigella e Salmonella. No meio CAM, a presença de colónias achatadas, pequenas, acinzentadas que crescem em atmosfera de microaerofilia, identifica Campylobacter intestinais (C.jejuni e C.coli).
A estirpe valorizada é isolada para posterior identificação e TSA.
Teste sangue oculto fecal
Na secção de microbiologia é também realizado um teste rápido imunocromatográfico para pesquisa de sangue oculto fecal, que ajuda ao diagnostico de
88
doenças gastrointestinais que não apresentam sintomas visíveis, como colites ou cancro do cólon.
Procedimento
Desenroscar e retirar o bastão da recolha da amostra e mergulhar o bastão em seis lugares diferentes na amostra de fezes. Em seguida, colocar o bastão no dispositivo da amostra e enroscar. Agitar, quebrar a ponta e colocar 3 gotas da amostra na cassete.
A amostra irá reagir com a membrana na região da linha de teste, que é coberta com anticorpo anti-hemoglobina. A mistura migra cromatograficamente, por cima da membrana, para reagir com o anticorpo, gerando uma linha colorida. (82)
Teste rápido C. Difficile
Este teste rápido consiste num ensaio imunoenzimático para a deteção simultânea do antigénio glutamato desidrogenase e das toxinas A e B do Clostridium difficile, em amostras de fezes. (83)
Este agente constitui uma causa significativa de doença gastrointestinal e apesar de poder ser cultivado em cultura, a maneira mais específica para diagnosticar a infeção é através da deteção de toxinas responsáveis pela doença. Muitos casos das formas mais leves de doença gastrointestinal e a maioria dos casos de colite pseudo-membranosa são causadas por estirpes toxinogénicas desta bactéria. (76,83)
As estirpes toxinogénicas produzem as duas toxinas, ou apenas a toxina B. O glutamato desidrogenase é um bom marcador pois é produzido em grandes quantidades por todas as estirpes. (83)
Procedimento:
É adicionada amostra ao tubo com os reagentes (diluente e conjugado composto por anticorpos da enzima e das toxinas com peroxidase de rábano) com incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente. Durante este tempo, a glutamato desidrogenase ou toxinas na amostra ligam-se aos conjugados e ocorre migração para uma membrana onde são capturados pelos anticorpos imobilizados na linha de teste. Uma linha na janela do antigénio significa que bactéria está presente na amostra e as linhas na área das toxinas indica se a estirpe é toxinogénica. Para validação do resultado, é necessário a visualização da linha também na janela do controlo. (83)
89
4.2.4.4.Aparelho respiratório
As infeções das vias respiratórias são muito frequentes, mas nem sempre são de origem bacteriana. O aparelho respiratório superior apresenta uma flora bacteriana comensal abundante, constituída por aeróbios e anaeróbios. Vários agentes patogénicos como S.pneumoniae podem estar presentes e ser isolados como flora transitória ou em pequeno número. (72)
Exsudado faríngeo Procedimento
A sementeira é realizada em GS e a placa colocada na estufa a 37ºC, em atmosfera com CO2, com observação às 24h e 48h.
Valorização dos resultados
O agente bacteriológico causador principal de faringite bacteriana é o Streptococcus pyogenes (S. β-hemolítico do grupo A), mas outras bactérias podem causar faringite, nomeadamente Neisseria gonorrhoeae, Corynebacterium diphtheriae e Mycoplasma pneumoniae, que normalmente necessitam de técnicas ou meios especiais para o seu isolamento. (72,76,79)
A estirpe valorizada é isolada para posterior identificação e TSA.
Expetoração /Secreções brônquicas/LBA Procedimento
Para exame direto é selecionada uma porção purulenta da amostra e são realizados dois esfregaços, em que um é corado por Gram e outro por Kinyoun (no caso do LBA, a amostra deve ser centrifugada durante 15minutos a 1500 rpm e usado o sedimento). O primeiro deve ser observado ao microscópio em objetiva de 10x, de modo a avaliar a qualidade da amostra em cerca de 10 campos, tendo em conta a presença de células epiteliais da orofaringe e leucócitos. Este procedimento normalmente não é necessário no LBA.
Para exame cultural, devem ser semeados os seguintes meios: o GS – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 48h;
o gelose Chocolate Haemophilus 2 (HAE2) - Incubação a 37ºC, 5%CO2, 48h;
90
o MCK - Incubação a 37ºC, 48h.
Valorização dos resultados
As amostras do trato respiratório inferior devem ser analisadas microscopicamente, pois pode ocorrer contaminação por bactérias das vias aéreas superiores. (76)
O exame bacteriológico de secreções respiratórias purulentas deve ser sempre realizado em casos de bronquite aguda. Os agentes bacterianos mais comuns que causam bronquite são a Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae. Os agentes mais comuns de pneumonia são Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae. (76,79)
No caso da expetoração e secreções brônquicas é feita primeiramente a verificação da qualidade da amostra, através do exame direto corado por Gram (na objetiva de 10x). Uma má amostra (maioritariamente saliva) é caracterizada por várias células epiteliais (>10/campo) e bactérias diferentes. Neste caso, é uma amostra conspurcada, e sugere-se repetição de colheita, independentemente do que se encontrar. A presença de leucócitos é a favor de infeção bacteriana e um tipo de bactéria em predomínio na cultura deve ser isolada e identificada. Na lâmina corada por Kinyoun é avaliada a presença de bacilos álcool-resistentes, nomeadamente Mycobacterium.
A valorização do crescimento bacteriano é realizada em função da história clínica do doente, dos exames corados e do crescimento em cultura. A estirpe valorizada é isolada em cultura pura, para posterior identificação e TSA.
4.2.4.5.Líquidos orgânicos
LCR
Procedimento
A amostra é centrifugada 15 minutos a 2000rpm. O sedimento é utilizado para preparar dois esfregaços, um corado por Gram e outro por Kinyoun e semear:
o GS – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 72h, com observação diária,
o gelose Chocolate + PolyViteX (PVX) – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 72h, com observação diária,
91 o caldo Coração-Cérebro (BHI) – Incubação a 37ºC, 72h, aerobiose, com observação diária. Caso apresente turvação, fazer passagem para meio sólido (GS).
Valorização dos resultados
Normalmente, o LCR para diagnóstico microbiológico, é analisado quando há desconfiança de meningite ou encefalite, sendo que esta última é principalmente provocada por agentes virais. Os principais agentes de meningite bacteriana são Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis. Outros agentes como Streptococcus do grupo B e Listeria monocytogenes são também comumente observados. A meningite bacteriana não tratada é geralmente fatal, pelo que o diagnóstico e determinação do agente bacteriano é urgente. Geralmente, bactérias aeróbias causam esta infeção, mas se existir um abcesso cerebral o agente etiológico pode ser uma bactéria anaeróbia. (76,79)
Na valorização dos resultados, deve ter-se em conta o exame citoquímico, se é patológico ou não, nomeadamente a presença de leucócitos. Todas as bactérias presentes no meio de cultura devem ser identificadas, sendo que o LCR é um líquido estéril, com posterior realização de TSA. A observação de esfregaço corado é importante, e qualquer resultado positivo deve ser comunicado ao médico imediatamente.
Outros líquidos orgânicos (pleurais, ascíticos, pericárdicos, sinoviais, bílis) Procedimento
Os líquidos límpidos devem ser concentrados por centrifugação (15 minutos a 1500 rpm) e as amostras purulentas podem ser inoculadas diretamente nos meios de cultura. Do sedimento preparar dois esfregaços, corados por Gram e Kinyoun e semear:
o GS – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, com observação diária;
o MCK (líquido ascítico ou bílis) – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, com observação diária;
o BHI – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, com observação diária (passagem para os meios sólidos se apresentar turvação),
o PVX (líquido pleural) – Incubação a 37ºC, 5%CO2, 48h.
Se o produto for enviado em meio de transporte adequado para anaeróbios, deve ser feito exame cultural, com sementeira em SCS e incubação a 37ºC, em anaerobiose, 5 dias, com observação de 48/48h.
92
O produto poderá também ser enviado em frasco de hemocultura, mas este deve ser acompanhado de outra amostra colhida para recipiente esterilizado seco, com tampa de rosca ou em meio de transporte próprio, de modo a poder ser realizado o exame direto. Do frasco de hemocultura, são feitas passagens às 48h:
o GS – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, OD;
o MCK (líquido ascítico ou bílis) – Incubação a 37ºC, aerobiose, 48h, OD; o VCA e HAE2 (líquido auricular) – Incubação a 37ºC, 5% CO2, 48h, OD; o HAE2 (liquido pleural) - Incubação a 37ºC, 5% CO2, 48h, OD.