Protocolo do estudo dos agregados plaquetas-monócitos e plaquetas-

O estudo da percentagem de agregados plaquetas-monócitos e plaquetas- neutrófilos foi realizado conforme protocolo original padronizado por Freitas et al (103). Os anticorpos utilizados foram previamente titulados, a fim de se obter a concentração ideal para os mesmos.

O protocolo utilizado nos experimentos é descrito a seguir. Alíquotas de 100µL de sangue total foram adicionadas a tubos de poliestireno 12x75mm contendo anticorpos monoclonais (Becton Dickinson Pharmingen®_{) dirigidos contra GP}

plaquetárias (anti-CD51/CD61), monócitos (anti-CD14) e neutrófilos (anti-CD16), conforme descrito na Tabela 2. Os tubos continham um controle interno de auto- fluorescência (branco) no qual o sangue foi incubado na ausência de anticorpos monoclonais. Os tubos foram homogeneizados em vórtex e, posteriormente, incubados à TA e ao abrigo de luz, durante 30 minutos.

Após o período de incubação, as amostras foram submetidas à lise das hemácias, utilizando 2mL de solução de lise (citrato trissódico dihidratado a 25g/L; heparina comercial a 5.000UI/mL; formaldeído a 54v/v; dietileno glicol a 30v/v; pH ajustado para 7,85) diluída 10 vezes em água destilada. Após nova homogeneização em vórtex, as preparações foram incubadas durante 10 minutos, à TA e ao abrigo de luz. Depois foram centrifugadas a 1.300rpm durante 7 minutos. O sobrenadante foi desprezado por inversão e o excesso foi retirado vertendo-se o tudo sobre papel absorvente. O pellet foi ressuspendido em vórtex e os leucócitos foram lavados com 2mL de PBS. As etapas de centrifugação e descarte do sobrenadante foram repetidas. O pellet foi então ressuspendido em 200µL de solução fixadora.

Tabela 2 – Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de agregados plaquetas-leucócitos.

Tubos Reagente/anticorpo Fluorocromo

Volume/

Concentração

Clone Fenótipo alvo

1 PBS - 20µL - - 2 e 3 Anti-CD51/CD61 FITC 1:1.300 23C6 Integrina heterodimérica αVβ3 2 Anti-CD14 PE 1:320 MϕP9 Monócitos

3 Anti-CD16 PECy5 1:1.500 3G8 Neutrófilos

_________________________

FITC: isotiocianato de fluoresceína; PE: ficoeritrina; PECy5: ficoeritrina-cianina 5

4.4.2.1 Aquisição e análise dos dados para determinação da percentagem de agregados plaquetas-monócitos e plaquetas-neutrófilos

Um total de 50.000 eventos por tubo foi obtido usando o citômetro de fluxo BD

LSRFortessa®_{. O software FlowJo}® _{foi utilizado para a análise dos dados.}

As diferentes estratégias utilizadas para análise do perfil de APM e APN estão representadas na Figura 5. A população dos monócitos foi selecionada a partir da combinação de anti-CD14 PE versus SSC. Foi realizado um gate, selecionando a população de interesse e posteriormente a combinação anti-CD14 PE versus anti- CD51/CD61 FITC para definir a percentagem de APM.

A análise seletiva dos neutrófilos foi estabelecida pela combinação de anti- CD16 PECy5 versus SSC. Foi realizado um gate, selecionando a população de interesse e posteriormente a combinação anti-CD16 PECy5 versus anti-CD51/CD61 FITC para definir a percentagem de APN.

Os resultados foram expressos como percentual da população CD51/CD61+_/CD14+ _{(APM) e CD51/CD61}+_/CD16+ _{(APN), correspondente ao}

Figura 5 – Estratégias utilizadas para a determinação da percentagem de agregados plaquetas-monócitos e agregados plaquetas-neutrófilos. Figuras obtidas utilizando-se o

software FlowJo.

4.4.3 Determinação do D-Di

A determinação dos níveis plasmáticos de D-Di foi realizada por ELISA de captura, utilizando-se o Kit IMUCLONE® _{D-Dimer (Sekisui Diagnostics}®_{, Alemanha),}

seguindo rigorosamente as instruções do fabricante.

O princípio do teste consiste na captura dos antígenos D-Di presentes nos plasmas testados, por anticorpos monoclonais de rato (anti-D-Di humano), fixados na superfície de uma placa. Os antígenos não capturados são retirados por lavagens sucessivas. Em seguida, adicionam-se os segundos anticorpos monoclonais de rato (conjugados com peroxidase), que vão se ligar a determinantes antigênicos do D-Di

Anti-CD16 PECy5 A n ti -C D51 /CD61 FIT C Anti-CD14 PE Anti-CD16 PECy5 Anti-CD14 PE Monócitos Neutrófilos SS C /Gr an u los id ad e SS C /Gr an u los id ad e 1,1% 98,9% 0,2% A n ti -C D51 /CD61 FIT C

Análise dos monócitos Análise dos neutrófilos

Agregados plaquetas-monócitos Agregados plaquetas-neutrófilos

(capturados na etapa anterior), distintos daqueles ligados aos primeiros anticorpos. Os anticorpos conjugados com peroxidase que não se ligaram ao D-Di são, posteriormente, retirados por lavagens sucessivas. A revelação dos antígenos capturados na primeira etapa é feita por meio da determinação da reação da enzima peroxidase (ligada ao segundo anticorpo) com o substrato orto-fenilenediamina (OPD), na presença de peróxido de hidrogênio. Essa reação resulta na formação de um produto corado e é interrompida pela adição de um ácido forte. A intensidade da cor produzida (determinada espectrofotometricamente) é diretamente proporcional à concentração do D-Di na amostra plasmática.

4.4.4 Determinação do PAI-1

A determinação dos níveis plasmáticos de PAI-1 foi realizada por ELISA de captura, cujo princípio é o mesmo descrito para o D-Di, utilizando-se o Kit IMUBIND®

PLASMA PAI-1 (Sekisui Diagnostics®_{, Alemanha), seguindo rigorosamente as}

instruções do fabricante.

4.4.5 Determinação do FVIII

A determinação dos níveis plasmáticos de FVIII foi realizada por ELISA de captura, cujo princípio é o mesmo descrito para o D-Di, utilizando-se o Kit IMUBIND®

FACTOR VIII (Sekisui Diagnostics®_{, Alemanha), seguindo rigorosamente as}

instruções do fabricante.

4.5 Análise estatística

A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o programa Minitab® _17,0

(Minitab®_{, Estados Unidos). A normalidade dos dados foi testada pelo método}

Shapiro-Wilk.

A comparação das médias entre os dois momentos da coleta em um mesmo grupo foi feita pelo teste T-pareado, para as varáveis com distribuição normal. Para os dados que não seguiam a normalidade, utilizou-se o teste de Wilcoxon para a comparação das medianas.

A comparação das médias entre os difere ntes grupos em um mesmo momento do ciclo menstrual (Jovens versus Jovens-ACO e Climatério) foi feita pelo teste T de

Student, para as variáveis com distribuição normal. Para aquelas que não seguiam a

normalidade, utilizou-se o teste de Mann Whitney para a comparação das medianas. O valor de p≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Para avaliar a associação entre contagem de plaquetas, biomarcadores de ativação plaquetária e marcadores hemostáticos, utilizou-se o coeficiente de correlação de Spearman. O índice de correção (ρ) foi utilizado para caracterizar a força da correlação, como fraca (ρ<0,36), moderada (0,36<ρ<0,67) ou forte (ρ>0,68). As correlações foram classificadas como negativas, com associação inversamente proporcional, se ρ<0,0 e positivas, com associação diretamente proporcional, se ρ>0,0. O valor de p≤0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

5 RESULTADOS