7.1 Estudo complementar acerca do papel funcional de homólogos de eIF4A em T.
brucei
A proteína helicase eIF4A, fator de tradução responsável pela remoção de estruturas secundárias durante a iniciação da tradução, apresenta dois homólogos nos tripanossomatídeos, tendo sua função sido inicialmente estudada em L. major (Dhalia et al., 2005). Contribuíndo para elucidação da função destas proteínas, os ortólogos do eIF4A de T. brucei (TbEIF4AI e III) foram estudados quanto à localização subcelular, determinação de seus níveis intracelulares e efeito da sua depleção (por interferência de RNA) na viabilidade/morfologia celular. Assim foi mostrado que o TbEIF4AI é citoplasmático, expresso em altos níveis e uma depleção mínima de 10% reduz drasticamente a síntese de proteínas, sendo essencial à viabilidade celular. Em contraste, o TbEIF4AIII é nuclear, moderadamente expresso e sua depleção só inibe a proliferação celular apenas quatro ciclos de divisão celular após sua interferência de RNA. De acordo com os dados obtidos, concluímos que as proteínas TbEIF4AI e TbEIF4AIII são respectivamente os homólogos funcionais do eIF4AI e eIF4AIII de mamíferos. A minha contribuição para este trabalho foi determinar os níveis intracelulares de ambas as proteínas e avaliar a depleção do TbEIF4AIII após a interferência de RNA em extratos prociclios de T. brucei. Adicionalmente, ainda realizei ensaios de interação entre as proteínas TbEIF4AI e TbEIF4AIII com a proteína de T. brucei homóloga a proteína humana Mago (Magoh), TbMago, associada ao mecanismo de degradação de mRNA em humanos. Estes resultados
127 fazem parte do artigo “The two eIF4A helicases in Trypanosoma brucei are functionally
distinct” publicado na revista Nucleic Acids Research, em 2006 (em anexo).
7.1.1 Análise da expressão das proteínas TbEIF4AI-III nas fases procíclicas e sanguíneas de T. brucei
Os anticorpos contra as proteínas TbEIF4AI-III, produzidos anteriormente (Rafael Dhalia, 2005 - Tese de Doutorado em Biologia Molecular, UNB) foram purificados por imunoadsorcão e utilizados para a determinação dos níveis intracelulares das respectivas proteínas endógenas nas fases procíclica e sanguínea de T. brucei. As proteínas recombinantes, TbEIF4AI e TbEIF4AIII, fusionadas a uma cauda de seis Histidinas, foram expressas e quantificadas, através de curvas de diluição das mesmas comparadas com concentrações conhecidas de albumina sérica bovina – BSA, em gel SDS-PAGE corado com azul de Coomassie. As proteínas recombinantes foram reveladas em ensaios de Western-blot comparando o sinal de detecção das mesmas com diluições seriadas de extratos protéicos totais de T. brucei nas fases procíclica e sanguínea (Figura 39). Os níveis de TbEIF4AI e III endógenos foram então estimados através de análises densitométricas, dos filmes de Western-blot, revelados por quimioluminescência (Dhalia et al., 2005). Os valores obtidos em fentomoles das proteínas TbEIF4AI e TbEIF4AIII para 105 e 106 células respectivamente, foram convertidos em número de moléculas por célula. A proteína TbEIF4AI foi quantificada em 2.4x105 e 6x104 moléculas por célula, respectivamente na forma procíclica e sangüínea T. brucei. A proteína TbEIF4AIII foi estabelecida em 2x104 e 4.5x103 moléculas por célula respectivamente na forma procíclica e sangüínea de T. brucei. TbEIF4AI foi considerada abundante e seus níveis intracelulares são compatíveis com os
128 níveis de seu ortólogo em L. major (Dhalia et al., 2005), assim como com o eIF4A de levedura (von der Haar e McCarthy, 2002). Os resultados da quantificação indicam que a concentração intracelular de TbEIF4AI é, pelo menos, 10 vezes maior que a de TbEIF4AIII. Adicionalmente, a concentração das proteínas TbEIF4AI-III na forma procíclica, foi considerada 4 vezes maior que na forma sangüínea.
Figura 39: Quantificação dos níveis intracelulares das proteínas TbEIF4AI-III nas formas procíclicas e sanguíneas de T. brucei. Diluições seriadas das proteínas TbEIF4AI-
III, em concentrações definidas (em fentomoles), foram fracionadas em gel 15% SDS- PAGE, com uma curva de diluição de células de ambas as formas procíclica e sanguínea (1.25 X 104–2 X 105para o TbEIF4AI e1.25 X 105–2 X 106para o TbEIF4AIII). Os valores
obtidos em fentomoles das proteínas TbEIF4AI e TbEIF4AIII para 105 e 106 células
129
7.1.2 Efeito da interferência de RNA nos níveis intracelulares da proteína
TbEIF4AIII
.
Para investigar a viabilidade dos parasitos in vivo, na ausência dos homólogos de TbEIF4AIII , foi utilizada a técnica de interferência de RNA (RNAi). O gene TbEIF4AIII foi clonado no cassete de expressão p2T7-177 (LaCount DJ et al., 2000), construído para indução de RNAi. Os genes clonados no plasmídeo p2T7-177, sob controle de dois promotores T7 em orientação reversa (regulados pela tetraciclina), são flanqueados por seqüências de T. brucei para integração genômica estável, nos seus mini-cromossomos. Os parasitos transfectados com a construção p2T7-177/TbEIF4AIII foi selecionado pela marca de resistência a fleomicina, para posterior análise do efeito da interferência de RNA através de curvas de crescimento, na presença e ausência de tetraciclina (+TET/- TET). Alíquotas de extratos protéicos, obtidos durante a realização do RNAi do TbEIF4AIII na concentração de 105 células/µL foram retiradas nos tempos 24, 48, 72 horas. O perfil de expressão da proteína TbEIF4AIII nas amostras do RNAi foi avaliado por Western-blot. Após 24 horas de indução do RNAi, a proteína TbEIF4AIII já não foi mais detectada no extrato total de T. brucei (Figura 40). Como esperado, os níveis da proteína TbEIF4AIII permanecem inalterados na interferência de RNA do TbEIF4AI.
130
Figura 40. Interferência do RNA TbEIF4AIII. Parasitas da forma procíclica foram
transfectados com a construção p2T7-177/TbEIF4AIII, monitorados quanto ao crescimento celular e analisados em relação à expressão do TbEIF4AIII. Análises dos experimentos de RNAi do TbEIF4AI e TbEIF4AIII por Western-blot, utilizando os anticorpos contra TbEIF4AIII, mostram a depleção específica da proteína TbEIF4AIII a partir das primeiras 24h de interferência.
7.1.3 - Interação entre homólogos do EIF4A com o homólogo à proteína Magoh em T.
brucei
Para avaliar a possível formação de um complexo de degradação de RNA nos tripanossomatídeos, similar ao complexo de Junção entre Éxons (EJC) descrito em humanos, as proteínas recombinantes TbEIF4AI e III fusionadas à proteína GST foram imobilizadas na resina Glutationa Sefarose 4B e incubadas com TbMago, marcada com 35S. Ambos homólogos do eIF4A ligam–se, fracamente, a proteína TbMago (Figura 41). Como esperado, a proteína TbEIF4AIII liga-se a proteína TbMago, como descrito para o fator eIF4AIII humano. A interação entre TbMago com TbEIF4AI pode acontecer em função da alta similaridade deste com TbEIF4AIII, entretanto pode não ser ocorrer in vivo devido as diferentes localizações das proteínas eIF4A em T.brucei. Estas interações serão
131 confirmadas por ensaios reversos de pull-down, imunoprecipitação, e por purificação por cromatografia de afinidade dupla (TAP-Tag). Para os ensaios de TAP-tag, onde é possível investigar a formação de complexos protéicos in vivo, já temos uma linhagem de T. brucei modificada para expressar a proteína TbEIF4AIII fusionada à um tag de purificação. Com estes estudos complementares, esperamos contribuir não só para o estudo da iniciação da tradução, como também para a investigação de processos celulares, relacionados a estes dois homólogos funcionais de eIF4A, em T. brucei.
Figura 41. Análise de interação entre os homólogos ao eIF4A e o homólogo Mago de