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IV) Linha celular – TZM-bl, infecção

3. Resultados

3.1. Produção de clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA

A reacção de amplificação por PCR do gene humano de A3G permitiu a adição, a montante e a jusante deste gene, das sequências codificantes do sinal de localização nuclear NLS (PKKKRKV) e do epitopo HA (YPYDVPDYA), respectivamente. A sequência NLS é responsável por encaminhar a proteína traduzida para o compartimento nuclear, enquanto o epitopo HA, por sua vez, é utilizado para permitir a detecção imunológica da proteína através de um anticorpo específico. Locais de clivagem para as enzimas de

restrição NotI e XhoI também foram adicionados, respectivamente, a 5’ da sequência de

NLS e a 3’ da sequência de HA (Figura 16 dos Anexos). Após hidrólise enzimática com as enzimas NotI e XhoI do inserto e do vector de expressão pcDNA3.1/Zeo(+), ligação vector:inserto e transformação da construção em bactérias electrocompetentes, obtiveram-

se colónias de bactérias TOP10F’ resistentes à marca de selecção (ampicilina) fornecida

pelo vector. Do total obtido, seleccionaram-se sete colónias isoladas e com crescimento uniforme, extraiu-se o DNA plasmídico por lise alcalina e após hidrólise com as enzimas NotI e XhoI observou-se o DNA por electroforese em gel de agarose. Este permitiu detectar, em quatro dos clones escolhidos, a presença de duas bandas distintas, uma com o tamanho aproximado do vector pcDNA3.1/Zeo(+) (~5000pb) e outra com tamanho correspondente ao gene humano da A3G (~1200pb). (Figura 8), Estes clones (#2, #4, #5 e #6) foram então classificados de positivos, por se ter comprovado o sucesso da construção. Mais tarde (após os ensaios de expressão e de degradação) a análise das

sequências nucleotídicas, obtidas por sequenciação automática, revelou que o clone #5 apresentava algumas mutações pontuais em relação ao gene da A3G e que não se observavam nos outros clones, pelo que este foi desconsiderado para os ensaios de infecciosidade realizados posteriormente.

3.2. A expressão dos clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA resulta

em proteínas menores que o esperado

O DNA dos quatro clones positivos pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA foi expresso em células HEK 293T, por transfecção pelo método de fosfato de cálcio, bem como o DNA dos controlos negativo e positivo (pcDNA3.1/Zeo(+) e pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA, respectiva- mente).Os extractos proteicos totais foram analisados por SDS-PAGE seguida de Western

~ 5000pb

~ 1200pb

Figura 8 | Obtenção de quatro clones positivos. Visualização por electroforese em gel de agarose dos clones que apresentam as bandas correspondentes ao vector pcDNA3.1/Zeo(+) e ao inserto NLS-A3G-HA.

R e s u lt a d o s

blot, e após três réplicas o resultado manteve-se: as proteínas codificadas pelo clones apresentam um tamanho menor (menos ~5kDa) que a do controlo positivo (46kDa) (Figura 9). No entanto, em alguns dos clones como é o caso do #5, é possível visualizar uma banda com tamanho superior muito semelhante ao tamanho da proteína expressa pelo controlo (ver seta ).

Este resultado poderá demonstrar que as proteínas dos clones sofrem algum tipo de clivagem, à qual a proteína selvagem não está sujeita; no clone #5 essa clivagem poderá não ter ocorrido em todas as moléculas de NLS-A3G-HA existentes nas células e por isso é detectada um pequeno número de moléculas com tamanho semelhante à A3G-HA. Sabendo que, teoricamente, a diferença entre os clones e o plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)- A3G-HA, reside apenas na sequência que codifica para a porção NLS, parece claro que esta sequência seja a responsável pela redução no tamanho das proteínas expressas. Pensa-se que, por algum motivo não identificado, a sequência-sinal NLS, juntamente com uma porção da extremidade N-terminal da A3G, são removidas da proteína sintetizada, possivelmente por mecanismos envolvidos na exclusão do núcleo. Outros ensaios de expressão foram tentados no sentido de compreender a origem desta diferença de tamanho.

3.3. A proteína NLS-A3G-HA é mantida no citoplasma da célula

Para analisar a capacidade da sequência NLS em exercer a função de encaminhamento para o núcleo das proteínas construídas, estas foram expressas novamente em células HEK 193T, no entanto, o extracto proteico foi recolhido com separação diferencial das proteínas do citosol e do núcleo, para se poder analisar qual a sua localização dentro da célula. Nas duas réplicas deste ensaio, após separação em SDS-PAGE e análise por Western blot, foi possível verificar que as proteínas produzidas se encontravam exclusivamente no citoplasma (Figura 10). De notar que neste caso é possível distinguir com clareza em todos os clones uma forma de NLS-A3G-

HA com um tamanho muito próximo do da proteína do controlo positivo, assim como a forma mais pequena (41kDa) já detectada anteriormente. A acrescentar, é detectada uma outra proteína

ainda mais pequena (~36kDa) Figura 10 | Localização citoplasmática de NLS-A3G-HA. Detecção por

Western blot da localização sub-celular das proteínas clonadas em células

HEK 293T, por extracção diferencial de proteínas do núcleo e do citosol. Figura 9 | Expressão de NLS-A3G-HA em células HEK 293T. Visualização por Western blot da expressão das proteínas codificadas pelos quatro clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA. α-HA α-GAPDH 46 kDa 37kDa α-HA 46 kDa α-PARP α-GAPDH 116 kDa 37 kDa

R e s u lt a d o s

resultante da clivagem de uma porção maior da extremidade N-terminal das proteínas construídas. Verificou-se assim que a sequência NLS não era capaz de realizar o seu efeito sinalizador, ou que, após o transporte, a NLS-A3G-HA seria novamente transportada para o citoplasma por um outro mecanismo, envolvendo possivelmente a clivagem da sequência NLS e de parte da extremidade N-terminal da A3G.

3.4. A localização celular não influencia o tamanho da NLS-A3G-HA

No sentido de tentar descortinar o fenómeno que envolve a clivagem da porção N-terminal das proteínas construídas, foi realizado um outro ensaio de expressão. Desta vez, as construções foram analisadas fora do contexto celular, através de uma reacção de transcrição e tradução in vitro, que utiliza o DNA dos clones

como molde. Após a reacção, o extracto proteico obtido foi purificado através de uma IP

com beads de agarose conjugadas com anticorpo α-HA(HRP). Novamente os extractos

foram analisados por SDS-PAGE e Western blot, sendo que os resultados obtidos não permitiram tirar novas conclusões: manteve-se a diferença de tamanho entre proteínas codificadas pelos clones (~41KDa) e a proteína usada como controlo positivo (46KDa) (Figura 11). Neste ensaio já não foram detectadas bandas superiores com tamanho muito semelhante ao da A3G-HA, mas verificaram-se novamente as proteínas mais pequenas de 36kDa anteriormente detectadas no ensaio de separação de extractos do núcleo e do citosol. Surpreendentemente, também foi possível visualizar uma versão truncada da proteína A3G-HA usada como controlo positivo, com sensivelmente a mesma diferença de tamanho (~5kDa) verificada nas proteínas NLS-A3G-HA. No entanto, esta proteína de menor tamanho apenas é visualizada após a IP, o que indica que os seus níveis celulares são muito baixos. Este resultado, embora corresponda apenas a um ensaio, representa um forte indício que a clivagem que ocorre nas proteínas construídas não é devida à entrada e/ou saída do núcleo das proteínas construídas, uma vez que mesmo quando os compartimentos celulares não estão presentes esta degradação se mantém.

3.5. A Vif do HIV-1 consegue induzir a degradação da NLS-A3G-HÁ

Apesar da redução no tamanho verificado em todas as proteínas codificadas pelos clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA, estas foram testadas no sentido de averiguar se

Figura 11 | Expressão de NLS-A3G-HA in vitro. Visualização por

Western blot das proteínas codificadas pelos clones pcDNA3.1/Zeo(+)-

NLS-A3G-HA, produzidas através de uma reacção de transcrição e tradução in vitro e purificadas (ou não, no caso dos controlos) por IP.

Imunoprecipitados Controlos

α-HA 46 kDa

R e s u lt a d o s mantinham a capacidade de interacção com a proteína Vif do HIV-1, e se consequente- mente eram degradadas pelos proteossomas celulares. Para tal, o DNA dos clones foi co- transfectado com o DNA do plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-vif

em células HEK 293T e os extractos proteicos separados em gel de poliacrilamida. A análise por Western blot nas duas réplicas deste ensaio permitiu detectar uma diminuição da quantidade de NLS-A3G-HA na presença da proteína Vif, em comparação com a proteína expressa na ausência de Vif (Figura 12). Mais uma vez, são visíveis os dois tipos de proteínas truncadas que sofreram clivagem por um processo ainda não desvendado. É de salientar que as proteínas com cerca de 41kDa são altamente sensíveis à degradação, principalmente no caso dos clones #5 e #6, em que a expressão de NLS-A3G-HA é significativamente diminuída para valores muito baixos ou indetectáveis. As proteínas com tamanho aproximado de 36kDa, por seu lado, aparentam ser ligeiramente menos sensíveis à Vif. Estes resultados demonstram que estas proteínas conseguiram interagir de forma eficiente com a proteína viral, a qual induziu a sua destruição. Curiosamente, neste ensaio a versão truncada da proteína produzida pelo controlo positivo apenas surge na presença de Vif, e não quando o controlo positivo é transfectado isoladamente, o que também permanece por justificar.

3.6. A proteína NLS-A3G-HA é encapsidada nos novos viriões

Após se demonstrar que a proteína NLS-A3G-HA é sensível à indução para degradação pela proteína Vif, surgiu a necessidade de averiguar se, tal como a desaminase selvagem, a proteína construída é ou não encapsidada nas novas partículas virais de NL4-3(Δvif) produzidas em células HEK 293T. A produção dos viriões foi conseguida pela co- transfecção de pNL4-3(Δvif) (e de pHEF-VSV-G) com o DNA dos clones que codificam as proteínas que codificam as proteínas

NLS-A3G-HA e do DNA do plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-vif, assim como de vários controlos. Após concentração e

lise dos viriões produzidos, os

extractos totais foram separados por electroforese em SDS-PAGE, e por

α-HA 46 kDa

Figura 13 | Encapsidação de NLS-A3G-HA nos viriões produzidos. Demonstração por Western blot da encapsidação das proteínas codificadas pelos clones nas partículas virais produzidas em células HEK 293T, tanto na ausência como na presença de Vif.

Figura 12 | Degradação de NLS-A3G-HA induzida pela proteína viral Vif. Detecção por Western blot da degradação das proteínas clonadas na presença de Vif, em células HEK 293T.

α-HA 46 kDa α-GAPDH 37 kDa pcDNA3.1/Zeo(+)-vif – – – – + + + + + + – – pNL4-3(Δvif) + + + + + + + + + – pcDNA3.1/Zeo(+)-vif – – – + + + + + – –

R e s u lt a d o s 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 A bs (5 5 0 nm )

Figura 14 | Inibição da infecção por NLS-A3G-HA. Níveis de infecciosidade viral em células Tzm-BL por viriões NL4-3(Δvif), produzidos em células HEK 293T. Valores representados correspondem a três réplicas simultâneas.

Western blot foi possível visualizar que a NLS-A3G-HA é encapsidada tanto na ausência como na presença de Vif (Figura 13). Aqui apenas a versão truncada de NLS-A3G-HA com 41kDa é observada nas amostras correspondentes aos clones. Porém, em relação ao clone #6 é notória uma diminuição da quantidade de desaminase encapsidada quando a Vif está presente, mas esta diferença pode não ser significativa uma vez que a quantidade de viriões em cada amostra não foi normalizada e este ensaio apenas foi realizado uma vez. Mesmo assim, é de notar que este clone foi o que demonstrou uma maior sensibilidade à degradação induzida pela Vif (Figura 12), embora a sequenciação automática tenha excluído qualquer diferença na sequência dos três clones #2, #4 e #6, pelo que esta variação considerável na sensibilidade à inibição pela Vif continua por esclarecer.

3.7. A infecção viral é inibida pela NLS-A3G

Por último, foi aferida a actividade anti-viral da proteína NLS-A3G-HA. Após a produção de viriões de NL4- 3(Δvif), estes foram utilizados para

infectar células Tzm-BL e a

infecciosidade viral foi medida

através da degradação do substrato CPRG pela enzima β-galactosidase, expressa por esta linha celular na ocorrência de produção viral. Os resultados obtidos revelam que os

viriões produzidos na ausência de Vif não são infecciosos, pois a infecção é abolida pela actividade anti-viral das proteínas NLS-A3G-HA (Figura 14). Quando a Vif está presente na célula produtora, esta consegue contrabalançar o efeito anti-viral das proteínas construídas, atingindo-se assim valores de infecção tão elevados quanto os obtidos na ausência da desaminase, embora continue por justificar a razão pela qual se observam variações tão grandes na capacidade de inibição dos três clones. Aliás, quando estão presentes as proteínas dos clones, a inibição na ausência de Vif é ainda mais potente do que a verificada aquando da produção viral na presença de A3G-HA do controlo positivo. Em contra-partida, os níveis de infecção com partículas produzidas na presença das proteínas dos clones e de Vif são ainda maiores do que quando a produção ocorre em células que expressam A3G-HA e a proteína viral. Estes resultados demonstram que seria necessário repetir várias vezes este ensaio no sentido de garantir com certeza os resultados e as assumpções que deles provêm.

pNL4-3(Δvif) + + + + + + + + + + – pcDNA3.1/Zeo(+)-vif – – – + + + + – + – –

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