RMN, Sensibilidade e Resolução de Sinais

Devido à mistura de componentes existente em um meio de degradação, a sobreposição de sinais é esperada em espectros de 1_{H, o que pode inclusive}

dificultar a contagem do número de compostos presentes em uma amostra. No presente trabalho, a escolha da RMN de 19F, no objetivo de calcular a porcentagem de degradação baseia-se na presença de um único átomo de flúor na molécula do fármaco em estudo, o que facilita a pesquisa dos produtos de degradação à medida que cada molécula que contém um átomo de flúor gera um único sinal no espectro. A RMN de 19F é uma técnica que oferece várias vantagens, pois a abundância isotópica é de 100%, trata-se de uma metodologia extremamente sensível (razão magnetogírica 0,83 relativa ao 1H), há ampla dispersão de deslocamento químico que possibilita sinais sem sobreposição e esse núcleo é extremamente sensível ao ambiente químico na molécula possibilitando a análise de misturas complexas.22

Ao contrário da espectroscopia de absorção UV-Vis e espectrometria de massas, onde a análise quantitativa só é possível através da comparação do sinal do analito com a resposta obtida para um padrão de análise, a análise quantitativa pode ser realizada com RMN usando qualquer composto não relacionado que contenha o núcleo de interesse. Considerando que em RMN quantitativo a área de cada núcleo ressonante é proporcional apenas à concentração molar da substância a qual pertence e ao número de núcleos que dá origem à ressonância, a análise quantitativa é possível para analitos novos ou desconhecidos presentes em misturas complexas, desde que haja resolução entre os sinais dos analitos e dos compostos de referência e que estes últimos forneçam padrões de deslocamento químico e largura da linha adequados para proporcionar a boa integração dos sinais.23

22

Infelizmente, a RMN é uma técnica sabidamente menos sensível que diversas outras, por exemplo, a espectrometria de massas. Avanços tecnológicos que permitam o aumento do campo magnético aplicado têm permitido melhorias substanciais na sensibilidade, o que se trata de um problema importante, à medida que na análise de impurezas em medicamentos como produtos de degradação, estes estão disponíveis em concentrações extremamente baixas na amostra. A RMN pode ser considerada um detector universal para hidrogênio e carbono, assim como outros núcleos magneticamente ativos, o que pode ser considerada uma vantagem, e por vezes uma desvantagem, já que há detecção dos sinais de solventes e substâncias majoritárias na amostra, por exemplo, o material de partida. A quantificação é precisa acima de quatro ordens de grandeza, embora não seja tão precisa quanto outras técnicas analíticas em baixas concentrações, o que faz com que a aplicação da RMN no estudo de misturas contendo componentes pouco concentrados, seja um desafio.24

Desde sua descoberta até os dias de hoje a RMN passa por inúmeros avanços quanto à sensibilidade como introdução de funções de apodização no processamento do FID, melhorias na eletrônica da sonda de RMN, melhorias nos pré-amplificadores, melhorias nos detectores de quadratura, digitalização em alta freqüência, melhorias nos magnetos, introdução dos supercondutores, transferência de polarização, cryo-sondas e DNP, levando ao aumento na relação sinal ruído o que a torna uma ferramenta importante na análise química de produtos de degradação que podem estar em baixas concentrações nas amostras (entre nano e pico molar).

Um dos problemas encontrados na técnica de RMN consiste na sobreposição dos sinais de ressonância, o que é típico de sistemas complexos e grandes moléculas. Analisando o caso do núcleo amplamente empregado, 1_{H: a}

espectroscopia de RMN de 1_{H é bastante sensível devido a abundância natural do}

isótopo (99,98%) e alta razão giromagnética [26,75 rad (sT) -1_{], porém a janela ou}

faixa espectral onde se observam os sinais de RMN de 1_{H é de aproximadamente}

20 ppm, enquanto os sinais da maior parte dos compostos orgânicos apresentam- se entre 0 e 8 ppm. No caso do núcleo 13_{C, as frequências de ressonância são}

23

observadas em uma faixa espectral muito maior (200 ppm), com sinais mais dispersos entre si, entretanto, a abundância isotópica e a razão giromagnética são baixas (1,1% e 0,25 da razão giromagnética do 1H respectivamente), tornando a espectroscopia de RMN de 13C muito menos sensível. Usando a RMN em campos magnéticos altos pode ser possível alcançar a sensibilidade e resolução necessárias, mas em espectros de RMN de amostras mais complexas os sinais podem continuar sobrepostos até mesmo em equipamentos de altas frequências como de 800 MHz que, além disso, ainda têm elevado custo financeiro.25

Outra estratégia para elucidação estrutural quando há sinais sobrepostos são os espectros bidimensionais que traçam mapas da correlação entre os núcleos envolvidos e através da correlação obtêm-se o deslocamento químico que, em um espectro unidimensional, não seria obtido em um mesmo campo magnético.

As mais variadas técnicas multidimensionais têm sido aprimoradas pela evolução dos equipamentos de RMN. Magnetos supercondutores com maior estabilidade do campo magnético e versatilidade no ajuste da homogeneidade, e

hardwares que permitem eficientes elaboração e precisão na programação das

sequências de pulsos são exemplos dos avanços que estão auxiliando nas metodologias de análise de compostos análogos que merecem cautela no mapeamento estrutural. As técnicas 2D permitem correlacionar hidrogênios e/ou carbonos que possuam alguma relação escalar (nJH-H, nJC-H, nJC-C) ou espacial

(H,H- ou H,C-NOE) entre si. Desta forma é possível fazer um mapeamento estrutural mais preciso do que utilizando somente as técnicas 1D na análise de estruturas mais complexas. Algumas técnicas de RMN 2D homonucleares estão resumidas abaixo:

COSY (homonuclear COrrelation SpectroscopY): com esta técnica pode-se

estabelecer as correlações entre os hidrogênios que estão acoplados por 2JH-H e 3_J

H-H (acoplamentos geminais e vicinais, mensuráveis no espectro de 1D) e assim

discernir a multiplicidade dos sinais observados no espectro de RMN de 1_H.

Eventualmente, sinais devidos a 4-6_J

24

TOCSY (Total Correlation SpectroscopY): a sequência TOCSY é um experimento

de correlação homonuclear que utiliza a técnica conhecida como “spin lock” para manter a magnetização no plano XY e estabelece as condições de Hartmann- Hahn, onde ocorre a transferência de polarização de um núcleo para outro, durante um período de tempo que é chamado de “tempo de mistura”. A magnetização se espalha a partir de um membro de um determinado sistema de spin para todos os outros membros desse sistema. Dessa forma em um mesmo espectro de TOCSY é possível obter-se correlações do tipo 1J, 2J, 3J,...NJ (onde

N≤7, dependendo do sistema estudado). Essa técnica é amplamente utilizada no estudo de peptídeos e oligossacarídeos, pois permite que até spins que não estejam diretamente acoplados, mas façam parte de uma mesma rede de acoplamentos, possam transferir polarização entre si. O experimento unidimensional TOCSY seletivo é uma versão do método bidimensional TOCSY em que um próton é excitado por um pulso formatado e este produz uma resposta para todos os prótons que estão conectados por acoplamento de spins numa mesma cadeia. Os experimentos TOCSY seletivos podem produzir resultados ainda mais claros quando realizados com gradiente (gs-TOCSY seletivo) que promove a perda ou ganho de coerência, não necessitando grandes ciclos de fases para seleção de coerências ou melhoria da relação sinal/ruído.27, 28, 29

NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY): têm o aspecto de um

COSY, contudo as correlações envolvem interações devidas ao NOE entre os hidrogênios que estão espacialmente próximos (em geral, menor que 6Å). Através desta técnica é possível estabelecer a configuração relativa de cada hidrogênio na molécula e geralmente a geometria molecular como um todo. A mesma informação pode ser obtida da difração de Raio-X, mas apenas para compostos na forma de um sólido cristalino.26

A maior diferença entre RMN unidimensional e bidimensional é a inserção do tempo de evolução, ou do tempo de evolução nesta última, onde se pode provocar a interação entre diferentes núcleos de várias maneiras dependendo da sequência de pulsos aplicada. Dessa forma, o FID resultante pode ser submetido a dois conjuntos de transformações de Fourier (t2, ou período de aquisição, em

25

função de t1, de evolução) para fornecer um espectro de RMN bidimensional em

dois eixos que se correlacionam através de uma dada propriedade desejada, oferecendo versatilidade e eficácia em uma série de vantagens como a diminuição do problema da sobreposição das linhas espectrais e a correlação de pares de ressonância.

Espectros de 2D heteronucleares como HETCOR (HETeronuclear

CORrelation spectroscopy) e COLOC (COrrelation spectroscopy for LOng-range

Couplings) assinalam carbonos que contêm hidrogênios com acoplamentos 1JC-H e

n_J

C-H respectivamente. Desta forma, eles fornecem informações quando são

executados juntos e caso já tenham sido assinalados todos os hidrogênios do espectro de RMN de 1H. Esses tipos de espectros demandam muito tempo de máquina, principalmente quando se analisam amostras diluídas. Esse problema ocorre porque a detecção é feita por intermédio do heteronúcleo pouco sensível onde o eixo horizontal (dimensão F2) corresponde ao deslocamento químico do núcleo 13C e o eixo vertical (dimensão F1) corresponde ao núcleo 1H. Essa limitação pode ser contornada com técnicas 2D heteronucleares em que a detecção é feita por intermédio do núcleo mais sensível. Sequências de pulsos envolvendo transições múltiplo-quânticas, denominadas de HMQC (Heteronuclear

Multiple Quantum Coherence) e HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

substituíram respectivamente os experimentos HETCOR e COLOC. Os espectros de HMQC e HMBC são editados com o eixo horizontal (dimensão F2)

correspondendo aos deslocamentos dos 1H e o eixo vertical (dimensão F1)

correspondendo aos deslocamentos dos 13_{C. O aumento de sensibilidade}

propiciado foi otimizado com a criação das sondas inversas em que a bobina do canal de 1_{H fica posicionada mais próxima ao tubo de amostra e a bobina do canal}

do núcleo menos sensível é a mais externa, conseguindo-se mais sensibilidade levando ao uso de menor tempo de máquina.26

Comunmente, o canal indireto é usado de duas formas: a primeira com a aplicação de pulsos duros e curtos com alta potência, a segunda maneira é aplicando uma sequência de desacoplamento pulsado (“composite pulse

26

detecção indireta através da utilização de sondas inversas também é uma forma de aumento de sensibilidade dos “núcleos X” analisados indiretamente, minimizando também o problema de baixa concentração da amostra.30

Outra alternativa para melhorar a sensibilidade e resolução espectral é utilizar sequências de pulso para detecção seletiva de determinados sinais. Pulsos seletivos têm sido cada vez mais utilizados, não somente em experimentos unidimensionais, mas também em bi e tridimensionais, devido à capacidade de reduzir a janela espectral desejada, levando ao aumento da resolução digital, podendo ajudar a resolver o problema da sobreposição de sinais e os problemas de aquecimento da amostra causados por pulsos de alta potência (pulsos adiabáticos). Estes experimentos exigem maior atenção na interpretação do espectro, que é menos óbvio que os espectros obtidos com pulsos não seletivos. O comportamento dos pulsos seletivos deve ser determinado experimentalmente, atentando-se para o formato, o tempo e a potência utilizada durante sua execução.25, 31, 32

O pulso de RF pode ser forte o suficiente para alcançar todas as frequências de um espectro, este é conhecido como “pulso duro”. Nessas condições o campo de RF (B1) é grande o suficiente para ser muito maior que o

campo reduzido B, e se essa situação é mantida o campo efetivo permanece ao longo de B1 como no caso de um pulso em ressonância, ou seja, quando ao

transmissor de frequência está exatamente na frequência de Larmor. Em termos de frequência, essa condição faz com que a frequência de precessão sobre B1

(1) seja capaz de cobrir a largura de um espectro inteiro com suas várias

ressonâncias. Nos casos onde o offset é comparável a B1 a consequência pode

ser um problema, ou pode ser transformada em um vantajoso tipo de RF para excitação seletiva. Quando se deseja excitar uma linha no espectro seletivamente, o transmissor deve estar em ressonância com essa linha e a potência do campo RF deve ser reduzida a fim de excitar apenas a faixa espectral desejada, obtendo- se o padrão de excitação demonstrado na Figura 10. A redução do campo RF depende da separação dos picos que se quer excitar. Quanto mais próximos estejam os picos indesejados, tanto mais fraco deverá ser o campo RF, tornando o

27

pulso de 90° mais longo. Esses pulsos são chamados pulsos seletivos ou soft

pulses.30

Figura 10 - No topo é mostrado o espectro quando usado o hard pulse. Ao

centro há uma representação do padrão de excitação quando o transmissor é colocado em ressonância com apenas uma linha e a força do campo RF é reduzida, resultando que os picos distantes do offset são atenuados como

mostra o espectro inferior. (Fonte: Adaptado de: Keeler, 2005).

A Figura 11 apresenta a excitação seletiva em um experimento TOCSY, onde os prótons são excitados por um pulso duro de 90° e depois perdem coerência por um pulso gradiente g1. Então um pulso de RF seletivo de 180° muda a ordem de coerência do próton escolhido e o ganho de coerência é novamente obtido através dos pulsos gradientes g2 e g3. O segundo gradiente é

seguido por um trem de pulsos “spin lock” (MLEV-16) que proporciona a retenção da ordem de coerência. A aplicação do último pulso gradiente permite o refoco dos deslocamentos químicos.25, 29 pulso duro pulso seletivo excitação transmissor janela

28

Figura 11 - Sequência de pulsos do experimento gs-TOCSY seletivo. a) Pulsos

duros de 90° e 180°, pulso Gaussiano de 180°. b) Três gradientes formatados sinusoidais, sem ciclização de fases. c) e d) Rota de coerência excitada e não excitada (respectivamente) do experimento. (Fonte: Adaptado de: Chernysh et al.,

2005).

Quando o produto de degradação está em torno de 10% e a amostra bem concentrada, é possível realizar o espectro de 13_{C e identificar os sinais menores}

como no caso das impurezas. Entretanto, em amostras mais diluídas e com menor percentagem de degradação, torna-se inviável a obtenção de um espectro de 13_C

29

uma concentração cujas correlações de impurezas serão bem inferiores às do produto majoritário. Técnicas uni e bidimensionais seletivas podem ainda ser úteis onde os produtos estão em concentração semelhantes dificultando a diferenciação entre eles, ou quando estiverem em número superior a dois.

Uma maneira de enriquecer ou melhorar as informações obtidas em um espectro de HMBC de uma amostra multicompostos, como pode ser o caso do meio de degradação de fármacos, é o aumentoda resolução da dimensão indireta. A resolução digital pode ser aumentada com a redução da janela espectral focando a faixa de frequência de interesse. Porém, reduzir a janela espectral em um experimento pode representar um problema, pois segundo a Condição de Nyquist, para caracterizar a frequência de um sinal de RMN corretamente, a amostragem deve ser no mínimo duas vezes o comprimento de onda, para que esse sinal esteja dentro da janela espectral, não sofrendo os efeitos chamados

aliasing ou folding que fazem com que os sinais não sejam condizentes com a

frequência irradiada real.33 A Figura 12 representa três diferentes amostragens de dados.

30

Figura 12 - A amostragem dos sinais (a) e (b) obedecem a Condição de Nyquist.

O padrão de amostragem do sinal (c) corresponde ao padrão do sinal de (a) e então é adquirido incorretamente como se o sinal estivesse a uma frequência

menor. (Fonte: Adaptado de: Clarige, 2009)

Na RMN moderna há o emprego de filtros digitais capazes de eliminar completamente sinais que estão fora da janela espectral determinada, evitando

aliased ou folded back, entretanto esses filtros aplicam-se somente na dimensão

amostrada diretamente em um experimento. Dessa forma, em experimentos bidimensionais de detecção indireta esses efeitos indesejáveis continuam a existir.30,33

Os efeitos denominados folding e aliasing aparecem no espectro final como um “rebatimento” dos sinais comprometidos sobre o espectro e o efeito surge como artefatos que não condizem com a região irradiada real.34 Os problemas devido a “folding” ou “aliasing” podem ser solucionados pelo uso de pulsos de frequências seletivas no canal do 13C de um experimento HMBC, o que possibilita

31

a redução da janela espectral utilizada em F1, aumentando a resolução para um

mesmo número de incrementos.35

Em experimentos com pulsos seletivos é bastante comum o aparecimento de artefatos oriundos da longa duração dos pulsos. Esse problema pode ser diminuído com o uso de PFG (gradiente de campo pulsado), sem ciclagem de fases, diminuindo a duração dos experimentos. Além disso, os pulsos gradiente melhoram o espectro pela seleção apropriada da coerência de diferentes estados de sistemas de spin nuclear, pois a defasagem e refoco dependem da razão giromagnética e das ordens de coerência no instante da aplicação do gradiente, portanto pode-se mudar a ordem de coerência entre os pulsos gradientes pela aplicação de pulsos de RF. Se pulsos de RF seletivos são aplicados entre os gradientes, apenas as coerências criadas por esses pulsos contribuem para o sinal resultante.25

Nos espectros de HMBC 1H-13C seletivos pode-se verificar a multiplicidade e o surgimento de uma inclinação nas correlações detectadas, isto provoca perda na sensibilidade e pode gerar dificuldade na elucidação de estruturas mais complexas com acúmulo de correlações em uma mesma região, especialmente em casos onde a quantidade da impureza inviabilize a obtenção de bons espectros de núcleos menos abundantes como 13C e 15N. Um esquema geral da espectroscopia de dupla dimensão está na Figura 13. Em experimentos de RMN de 2D, durante o tempo de evolução (t1) adquiri-se o FID resultante da sequência

de pulsos executada quando t1=0, então é permitido aos spins nucleares retornem

ao equilíbrio. Quando t1=1 (intervalo de amostragem) a sequência de pulsos é

repetida e um novo FID é adquirido e armazenado separadamente do primeiro. Novamente é permitido aos spins voltarem ao equilíbrio. Da mesma forma, t1 pode

ser 21, 31, 41, ou quantas vezes forem necessárias repetir a sequência, sendo

32

Figura 13 - Esquema geral de experimentos de RMN de 2D.

Durante t1 ocorre a evolução de JH-H que causa alargamento dos sinais de 13_{C na dimensão F}

1. Esse problema fica ainda mais evidente no caso do

experimento seletivo, pois o aumento da amostragem para ganho de resolução na dimensão F1 aumenta também o tempo de aquisição, o que por sua vez aumenta

o efeito da modulação JH-H, ocasionando perda de sinal.

Os experimentos CT-HMBC introduzem o período de evolução de tempo constante antes e depois do pulso de 180º. A proposta é conter a evolução JH-H

devido ao acoplamento homonuclear 1H-1H durante t1 através da inversão do sinal

da magnetização durante o tempo de evolução (t1/2 + (Δ2 - t1/2)) depois do pulso

de 180º para refoco apenas dos deslocamentos químicos. Assim o efeito da evolução JH-H permanece inalterado durante o período constante e a divisão dos

sinais devido ao acoplamento 1H-1H na dimensão F1 é suprimida.36

A Figura 14 ilustra uma sequência de pulsos usada em um experimento de HMBC seletivo que usa um pulso simples de gradiente de campo spin eco (SPFGSE) no canal do 13C para alcançar a excitação seletiva no domínio F1 e

ainda coloca intervalos de tempo variáveis (Δ2 – t1/2) junto com os períodos de

evolução t1 e SPFGSE para manter constante o período de tempo da evolução do

acoplamento de hidrogênios. Dessa forma, qualquer que seja o valor de t1, o

período (Δ1 – ΔCT) permanece constante, fazendo com que não haja modulação

dos dados de evolução do acoplamento JHH e assim o espectro fica livre das linhas

33

Figura 14 - Sequência de pulsos do CT-HMBC seletivo de tempo constante. As

barras estreitas indicam pulsos de 90° e as barras largas pulsos de 180°. O pulso seletivo no canal do 13_{C está na forma de meio-seno. Todas as fases de pulso}

estão em x. O intervalo Δ1 é para a evolução de nJCHe Δ2 é igual a t1(máx)/2. Como

t1é incrementado, os períodos (Δ2 - t1/2) são decrementados para que o período

ΔCT permaneça constante. Pulsos de gradiente são aplicados na razão 3:-5:4,01

35