Testes do dispositivo de PDMS laminado-vidro

Os testes iniciais com o dispositivo de PDMS laminado-vidro (Projeto I) também mostraram alguns problemas operacionais, que levaram à necessidade de adaptações. Os detalhes são apresentados no ANEXO IV. Conforme apresentado neste anexo, as fibras foram inseridas na tampa de vidro e seladas com resina epóxi, o que forneceu proteção mecânica extra e garantiu que elas permanecessem fixas às posições corretas. Além disso, as 3 microcâmaras abaixo de um mesmo microcanal foram fundidas, o que aumentou o número de partículas detectadas pelo sensor e, consequentemente, o grau de confiança das estatísticas de autocorrelação da intensidade (HUNTER, 2004; SALEH e TEICH, 1991). Por fim, retornou-se à ordem original de posicionamento das camadas de PDMS, de Vit et al. (2018): o canal de escoamento foi transferido ao nível superior, acima das microcâmaras, garantindo que, devido à ação gravitacional, o fluido das câmaras não perderia contato com as fibras. Este novo design é mostrado na Figura 54 (SOARES et al., 2019).

Figura 54. Visão geral do microfermentador instrumentado do Projeto I (adaptado de SOARES et al. 2019). A Figura 55 representa os experimentos realizados com esta configuração de microrreator, com concentrações de sacarose iguais nas duas entradas e variando entre 2,5 a 30 g/L para cada experimento, conforme exposto na Seção 3.8. O eixo principal da

Figura 55 representa a concentração de células estimada com a curva de calibração,

enquanto que o eixo secundário mostra o valor de taxa média de decaimento efetivamente calculado.

Figura 55. Curvas cinéticas obtidas para as concentrações de sacarose variando entre 2,5 a 30 g/L.

É possível notar na Figura 55 que todos os experimentos apresentaram um novo tempo médio de latência de ~ 3h, correspondente ao período necessário para que as células se adaptem ao ambiente das microcâmaras.

A Figura 56(A) representa, por sua vez, o sinal de intensidade óptica refletida normalizada obtido pelo sensor ao final do experimento com concentração de sacarose de 30 g/L, o máximo espalhamento observado. É possível calcular a relação sinal-por- ruído (“signal-to-noise ratio”, SNR), como SNR = μ²/σ², onde μ é o valor médio e σ é o desvio-padrão do sinal (SALEH e TEICH, 1991). Obtém-se, assim, o valor SNR = 4,169 x 105.

Como o aumento da dispersão é causado pelo espalhamento da luz (máximo neste caso), esta é a menor SNR obtida. Este resultado também pode ser analisado em termos do intervalo μ ± 3σ = 1,000 ± 0,005, muitas vezes tomado como a incerteza total da medida. A Figura 56(B), por sua vez, mostra a curva de autocorrelação G2(τ) correspondente à Figura 56(A), sendo destacado o decaimento exponencial característico do espalhamento de luz (relação de Siegert, Equação 21), que permite a avaliação de ̅.

Figura 56. (A) Sinal de intensidade refletida normalizada ao fim do experimento com concentração de sacarose 30 g/L, destacando o intervalo μ ± 3σ = 1,000 ± 0,005; (B) curva de autocorrelação G2 (τ) correspondente à Figura

56(A), destacando o decaimento exponencial característico do espalhamento de luz.

A minimização dos desvios entre valores experimentais e simulados ocorreu para a curva de Monod construída com os parâmetros KM = 4,1 g/L (mantido fixo) e μm

= 0,49 h-1. A Figura 57 mostra os dados experimentais comparados aos modelos ajustados, quando se elimina os tempos de latência de 3 h.

Figura 57. Comparação dos dados experimentais com as curvas de Monod ajustadas para os parâmetros μm = 0,49 h-1 e KM = 4,10 g/L, retirando-se os tempos de latência (3 h iniciais).

O parâmetro cinético μm aferido com o microfermentador é consistente com o da cinética em batelada (volume reacional de 25 mL), mostrando uma pequena diferença de apenas 2%. Esta diferença pode ser explicada pela incerteza do procedimento visual, 20 - 30%, pela modificação do modo de operação e do volume empregado, e também pela evolução temporal do microrganismo durante os sucessivos ciclos de crescimento. Outra hipótese é que, devido ao volume muito menor do microrreator, as leveduras conseguem se adaptar mais facilmente e sofrer reprodução intensa antes de saturar o meio, o que reduz levemente o total de crescimento alcançável.

Ao se analisar a Tabela 8, percebe-se que os valores encontrados são coerentes com a literatura: há relatos de μm variando entre 0,17 a 0,50 h-1 (JAIN, 1970; SONNLEITNER e KÄPPELI, 1986) e de KM entre 0,099 a 4,56 g/L (KOREN e DUVNJAK, 1993; VERDUYN et al., 2015). Este intervalo de possibilidades para os parâmetros cinéticos reflete as diferenças entre as linhagens de microrganismos, entre os substratos utilizados, e entre as metodologias empregadas para avaliação.

Por fim, o experimento de fermentação utilizando concentração de sacarose de 30 g/L foi repetido, mas com outra tampa de vidro que não à selada às fibras ópticas. Isto permitiu a visualização das microcâmaras com o microscópio invertido, bem como a comparação com os resultados do sensor e com o teste de fermentação em batelada.

Uma vez que as leveduras apresentam elevados diâmetros e, consequentemente, baixos coeficientes de difusão (WELTY et al., 2008), e como também não apresentam quimiotaxia, mantendo-se em posição espacial aproximadamente constante ao longo do tempo (OLIVEIRA et al., 2016; VIT et al., 2018), é possível escolher regiões das microcâmaras com distribuição aproximadamente uniforme de leveduras e criar divisões virtuais de volume nas quais é analisado o crescimento celular.

Assim, foram delimitadas regiões quadradas de 200 μm de lado, sendo a altura considerada igual à espessura da camada de PDMS (500 μm), o que resultou em volumes de análise de 2 x 10-5 mL. Um dos volumes escolhidos é mostrado na Figura

58 para o instante inicial e para o tempo de 4 h, quando o experimento foi encerrado. A Figura 59, por sua vez, mostra uma região de formação de colônias de leveduras

observada em uma das microcâmaras ao fim de 4 h, região que não foi considerada adequada para a estimativa de concentração de células, tanto pela dificuldade em se contar células individuais quanto pela não-homogeneidade de concentração local.

A Figura 58 foi obtida utilizando-se lentes objetivas de magnificação igual a 10 vezes, enquanto que a Figura 59 foi registrada com lentes com 2 magnificações diferentes, 10 vezes para a imagem superior e 20 vezes para o detalhe inferior. Vale notar que, além da magnificação nominal das lentes objetivas, a câmera do microscópio também apresenta aumento de 10 vezes.

Figura 58. Porção quadrada das microcâmaras (quadrado de lado igual a 200 μm, resultando em volume de 2 x 10-5 mL) utilizada para estimativa visual do crescimento celular. A mesma porção é mostrada em dois momentos distintos do experimento: (A) início, t = 0 h; (B) fim do experimento, t = 4 h, sendo possível notar o aumento da

quantidade de leveduras (pontos escurecidos) na parte esquerda dos detalhes inferirores.

A Figura 60 mostra a comparação entre os dados obtidos no experimento de fermentação em batelada, no experimento do microrreator instrumentado (Projeto I) com concentração de 30 g/L, e no experimento com o microrreator visualizado ao microscópio.

É possível perceber que as três curvas apresentam formatos semelhantes e mesma ordem de grandeza de concentração celular estimada. Entretanto, o resultado obtido pela avaliação do microrreator com microscopia é o menos confiável dos três: como mostrado na Figura 59, existem regiões do reator com formação de colônias e que, portanto, apresentam concentração local mais elevada. Devido ao aspecto tridimensional destas colônias, não há como saber a quantidade exata de células nestas regiões e, caso estas células estivessem distribuídas homogeneamente pelas câmaras, o valor obtido de concentração seria superior.

Além disso, existe a questão da estimativa do volume, que não só não leva em conta a contração de altura do PDMS relacionada à forte adesão PDMS-vidro e à pressão externa exercida pelas bordas acrílicas parafusadas, mas também foi feita com base na hipótese de que as células sempre permanecem fixas nas câmaras virtuais. É uma hipótese que desconsidera o efeito de migração para formação de colônias, a difusividade das células, e o deslocamento causado pela divisão celular. O sensor de

fibra óptica, por outro lado, não apresenta estes problemas, pois a taxa de decaimento médio representa uma propriedade total do meio externo às fibras e é relacionada ao movimento Browniano.

Assim, a maior importância das Figuras 58 e 59 está na comprovação visual de que existe crescimento microbiano no interior das microcâmaras e de que as células são aproximadamente esféricas, com diâmetros da ordem de 1 μm. Enquanto isso, os resultados obtidos pelos ajustes da fermentação em batelada e pelos experimentos com o microfermentador instrumentado estão em elevada concordância entre si e com a literatura, como resumido na Tabela 8, de modo que é possível concluir pela eficiência e pela confiança do uso do sensor para o monitoramento da fermentação.

Uma observação final pertinente ao conjunto total dos resultados é que existe uma dependência intrínseca entre ̅ e o comprimento de onda λ utilizado. Isto ocorre porque os materiais podem apresentar dependência entre os seus índices de refração e o comprimento de onda de excitação, e pelo fato de que as partículas devem ser comparáveis em grandeza a λ para que o DLS seja observado.

Portanto, tendo em vista o efeito de variação da modulação da luz (Equação 15), é aconselhável que seja feita a construção de uma nova curva de calibração sempre que se trabalhar com comprimentos de onda diferentes. Uma alternativa ao procedimento da câmara de Neubauer é a correlação de sinal com a medida de massa seca, obtida por meio da retirada de alíquotas de volume líquido conhecido, seguida pela centrifugação e obtenção da massa de células contidas naquele volume. Tal procedimento, contudo, só deve ser utilizado quando o acúmulo de massa for proporcional ao crescimento celular, o que não ocorre com fungos filamentosos, por exemplo (ANDRADE et al., 2009; DORAN, 2013).

Tabela 8. Comparação entre parâmetros cinéticos calculados e os valores da literatura.

μm

(h-1)

KM

(g/L)

Referência

0,49 4,1 (obtido com o microrreator)

0,50 - (fermentação em batelada) 0,42 4,1 Atala et al. (2001) 0,32 0,27 Oliveira et al. (2016) 0,17 0,5 Sonnleitner e Käppeli (1986) 0,24 4,56 Koren e Duvnjak (1993) 0,50 0,187 Jain (1970) 0,40 1,51 Papagianni et al. (2007) 0,42 0,50 Amillastre et al. (2012) 0,31 0,099 Verduyn et al. (2015) 0,49 3,6 Postma et al. (2000)

Figura 59. Região de formação de colônias de leveduras observada em uma das microcâmaras após 4 h de experimento, obtida com lentes de magnificação igual a 10 vezes (imagem superior) e magnificação de 20 vezes

(detalhe inferior), permitindo a observação das morfologias das células que formam colônias.

Figura 60. Comparação entre os dados coletados durante a fermentação em batelada (curva “Batelada”), com o microfermentador instrumentado (curva “OFS”) e por visualização do interior do microrreator (curva “Microscopia”).