3.2 Resposta imune ao Toxoplasma gondii

3.4.2 Toxoplasmose ocular no modelo experimental

O modelo experimental é muito importante para estudar aspectos da doença que por motivos éticos seriam impossíveis de serem estudados em humanos, além de apresentar a vantagem da possibilidade de controle das condições do experimento (linhagem do hospedeiro, cepa do parasita, tamanho do inóculo, via de infecção e outras), o que não ocorre na infecção natural. Como observado em outras doenças parasitárias, a patologia da infecção pelo T. gondii resulta da interação entre fatores do parasita e do hospedeiro. Assim, os resultados obtidos por diferentes laboratórios dificilmente são comparáveis, uma vez que os modelos experimentais geralmente não são idênticos, já que há variações do animal hospedeiro, via de infecção, cepa do Toxoplasma utilizada para a infecção, condições da cultura, e mesmo no número de passagens do parasita (ZENNER et

al., 1998).

O primeiro a produzir um modelo experimental de toxoplasmose foi HOGAN (1951) usando coelhos infectados com taquizoítas inoculados na carótida causando uma retinocoroidite aguda. FRENKEL (1953) infectou hamsters por via intraperitoneal com a cepa EK (sublimado da cepa RH) de T. gondii e demonstrou o desenvolvimento de retinite e irite, caracterizadas pela necrose e exsudato mononuclear, durante a fase crônica da infecção. JACOBS et al. (1954) e

BEVERLEY et al. (1954) descreveram independentemente o surgimento da toxoplasmose ocular após uma injeção de parasitas na câmara anterior dos olhos de coelhos. BEVERLEY (1961) mostrou infiltração coroidiana e presença de cistos de

Toxoplasma em todos os tecidos da úvea de coelhos inoculados com T. gondii na

câmara anterior. GARWEG (1998), utilizando a inoculação intravítrea de taquizoítas da cepa BK (avirulenta) em coelhos, observou o desenvolvimento de retinocoroidite e infiltrado inflamatório no vítreo, além de descolamento de retina e catarata que foram consideradas como complicações da via intravítrea. O coelho é freqüentemente escolhido como modelo experimental por se tratar de animal susceptível e com olhos grandes o suficiente para uma boa oftalmoscopia, diferente de animais de menor porte (NOZIK & O’CONNOR, 1971).

Um estudo sobre oftalmite toxoplásmica em animais concluíu que a ocorrência do T. gondii é mais comum na coróide e no corpo ciliar do que na retina, na maioria dos animais, inclusive nos gatos (PIPER et al., 1970). Os componentes celulares das lesões intraoculares consistiam principalmente de macrófagos, linfócitos e alguns plasmócitos, observados principalmente ao redor dos vasos.

PAVESIO et al. (1995) utilizaram o hamster inoculado via intraperitoneal com cistos da cepa ME 49 de T. gondii e encontraram retinocoroidite em ambos os olhos de todos os animais em fotografias do fundo de olho. O exame histopatológico dos olhos mostrou cistos e lesões na retina.

Um modelo animal de pequeno porte é necessário para estudos controlados e de larga escala, para pesquisa do desenvolvimento, progressão e resolução da toxoplasmose ocular em resposta aos vários tratamentos. Estudos no modelo murino têm sido amplamente utilizados devido a maior facilidade de obtenção dos animais, especialmente quando são utilizados animais mutantes, o que ocorre frequentemente em experimentos na área de imunologia.

O olho do camundongo, bem como do humano, é composto por três túnicas: túnica externa (esclera, limbo e córnea), túnica média ou úvea (íris, corpo ciliar e coróide) e túnica interna (retina)

A retina é composta por 10 camadas paralelas: 1) epitélio pigmentar da retina (EPR), composto por uma camada de células cubóides, densamente pigmentadas

(melanina); 2) camada de fotorreceptores, que contém o segmento externo dos fotorreceptores (FR) sensível à luz; 3) membrana limitante externa, uma linha tênue, acelular, de coloração rósea à coloração por HE e que separa as camadas de FR e a camada nuclear externa; 4) camada nuclear externa, formada pelos núcleos dos FR; 5) camada plexiforme externa, onde ocorrem as sinapses entre os FR e as células bipolares e horizontais; 6) camada nuclear interna, composta pelas células bipolares, horizontais, amácrinas e células gliais de Müller; 7) camada plexiforme interna, região onde ocorrem as sinapses entre as células bipolares, as ganglionares e as amácrinas; 8) camada de células ganglionares; 9) camada de fibras nervosas e 10) membrana limitante interna, que não é vista neste cortes. Nas camadas internas (de 6 a 10) estão localizados os vasos da retina, formados por endotélio tênue.

DUTTON & HAY (1983) evidenciaram em olhos de camundongos congênitamente infectados uma destruição tecidual que variou de pequena a total com calcificação distrófica. Entretanto, alguns camundongos não apresentaram nenhuma anormalidade.

TEDESCO et al. (2005) demonstraram que camundongos C57BL/6 submetidos à instilação conjuntival de 5 x 103 bradizoítas da cepa ME 49 de T. gondii desenvolvem toxoplasmose ocular progressiva semelhante a que ocorre nos camundongos infectados por injeção intra-vítrea, porém sem as lesões no cristalino e retina decorrentes desta última via de inoculação.

Experimentos com o modelo murino indicam o INF como a citocina crucial para resistência contra o T. gondii (GAZZINELLI et al., 1994; GRAVILESCU & DENKERS, 2001). Estudos mostram que o TNF-α exerce ação sinérgica com o INF na defesa contra o T. gondii (GAZZINELLI et al., 1994). IL-10 age regulando negativamente a produção de INF em camundongos C57BL/6 e BALB/c, sendo importante para o equilíbrio entre a imunidade protetora e o controle da inflamação (SUZUKI et al., 2000). MARX-CHEMLA et al. (1993) demonstraram que parasitas passam para a câmara anterior através da circulação do humor aquoso onde também são encontrados anticorpos anti-T. gondii. Infecções experimentais em camundongos mostram que células T CD8+ e CD4+ são necessários para evitar a multiplicação parasitária irrestrita, demonstrando a importância da imunidade celular no controle da infecção (GAZINELLI et al., 1992). CALABRESE et al. (2007)

compararam o nível sérico e na câmara anterior de diversas citocinas durante a infecção pelo T. gondii em camundongos C57BL/6. Apesar dos muitos estudos na área, os mecanismos imunes que controlam a toxoplasmose ocular ainda não estão totalmente claros.

4 Apoptose

Do ponto de vista morfológico e bioquímico, a apoptose é uma forma distinta de morte celular, geneticamente programada, que elimina células indesejadas (supérfluas ou defeituosas) (LÜDER et al., 2001). É filogeneticamente antiga, presente em todos os organismos multicelulares (GAVRILESCU LC & DENKERS, 2003a). É um processo ativo, dependente de energia, com controle intrínseco, influenciado por fatores externos.

KERR et al. (1972), foi quem primeiro descreveu a apoptose como forma distinta de morte celular, e propôs o termo apoptosis (originado do grego) para denominá-la. O termo significa “queda” ou “separação” e foi utilizado em analogia à queda das folhas das árvores no outono, uma alusão ao papel da apoptose como reguladora da população celular (CUMMINGS et al., 1997).

Vários aspectos diferenciam a apoptose da necrose: 1) a apoptose é um processo ativo, que necessita de energia e é caracterizada por uma cascata de eventos bioquímicos decorrente da ativação e expressão de genes específicos e síntese de proteínas; 2) na apoptose não há extravazamento de conteúdo celular para o interstício e consequentemente não há inflamação e danos às células vizinhas e 3) enquanto a necrose envolve grupos de células, a apoptose é um processo que afeta a célula individualmente (WILLIE et al., 1980; SEARLE et al., 1982).

WILLIE et al. (1980) descreveram morfologicamente a apoptose. Inicialmente a célula em apoptose perde o contato com as células vizinhas (anoiquia – FIG 1A) deixando um halo ao seu redor, o núcleo apresenta condensação da cromatina junto da membrana nuclear formando figuras crescentes (FIG 1C), ocorre condensação do

citoplasma e aparecem protuberâncias na superfície externa da célula (zeiose – FIG 1B, C e D). As organelas tornam-se compactas, mas permanecem estruturalmente intactas. Ocorre a fragmentação nuclear (FIG 1E) e a formação dos corpos apoptóticos a partir das protuberâncias na superfície celular (FIG 1F). Alguns corpos apoptóticos contêm mais de um fragmento nuclear enquanto que outros contêm apenas elementos citoplasmáticos (SEARLE et al., 1982).

Os corpos apoptóticos são rapidamente fagocitados por células vizinhas (FIG 1G), bem como por macrófagos, monócitos, células epiteliais, endotélio vascular e células tumorais. A apoptose é um processo que está continuamente acontecendo, mas é raramente observada em animais saudáveis, pois as células apoptóticas são potentes gatilhos da fagocitose e, deste modo, são rapidamente removidas do meio. A eversão da fosfatidilserina (um fosfolípide presente na supefície interna da membrana celular de vertebrados) através da ação das flipases é um importante sinalizador para que corpos apoptóticos e/ou células em apoptose sejam fagocitadas (MARTIN et al., 1995; HACKER, 2000). Outros receptores moleculares, dentre estes moléculas da família das citoadesinas, estão também relacionados com a sinalização para fagocitose específica da apoptose.

A apoptose pode ser desencadeada por meio de três vias principais em resposta a estímulos externos ou internos: 1) junção de um ligante ao seu receptor de morte na superfície da célula – via do receptor de morte (TIBBETTS et al.; 2003); 2) liberação do citocromo C da mitocôndria para o citosol – via mitocondrial (GREEN & REED, 1998) ou 3) liberação de granzima por células NK e CTL – via grânulos- dependente (LIEBERMAN, 2003).

FIGURA 1 – Morfologia da apoptose:

A) Anoiquia; B) Zeiose; C) Condensação da cromatina, formando crescentes; D) Condensação da cromatina, formando o “buraco negro”; E) Fragmentação do núcleo; F) Corpúsculos apoptóticos; G) Canibalismo celular.

Na via extrínseca, ocorre a sinalização do meio extracelular para o intracelular através de receptores de morte na superfície, como o Fas produzido pelas células do sistema imune que se liga à molécula ligante Fas L. Pode acontecer também pela ativação da super família dos receptores do fator de necrose tumoral alfa (TNF R1, TNF R2), pelo seu ligante TNF-α ou pela ligação dos receptores do ligante indutor da apoptose relacionado ao TNF (TRAIL R1, TRAIL R2) ao seu ligante TRAIL. O receptor, após ser ativado pelo seu ligante, trimeriza-se e sua porção citoplasmática se liga a uma proteína adaptada. Essa proteína pode ser a TRADD (TNF receptor

apoptotic death domine) no caso do TNF-α, ou a FADD (Fas-associated death domain) no caso do Fas (GAVRILESCU & DENKERS, 2003a). Ocorre então a

ativação da cascata enzimática intracelular envolvendo “proteases de cisteína aspartato-específicas” ou “cisteíno-proteases” conhecidas como caspases. As caspases são encontradas como proenzimas em células não estimuladas. Durante a ativação, um prodomínio N-terminal de 3 a 24 kDa é clivado, e a enzima remanescente é dividida em uma subunidade maior (17 a 21 kDa) e uma menor (10 a 13 kDa), que juntas formam a molécula ativa. Inicialmente são ativadas as caspases iniciadoras (caspases 8 e 10) que irão por sua vez clivar a procaspase 3 transformando-a em sua forma ativa, a caspase 3. A caspase 3 (caspase efetora) irá promover os eventos que culminarão com a morte celular (NICHOLSON, 1999).

A via intrínseca da apoptose ou a via mitocondrial ocorre devido ao aumento da permealidade da membrana mitocondrial ao citocromo C, induzido por irradiação

gama ou ultravioleta, agentes tóxicos, estresse celular, radicais livres ou falta de fator de crescimento (GREEN & REED, 1998). O citocromo C é normalmente encontrado no espaço entre as membranas externa e interna da mitocôndria, e quando liberado para o citoplasma liga-se a Apaf-1 (apoptosis activating factor 1) que na presença de ATP ativa a caspase iniciadora 9 (GREEN & REED, 1998). A caspase iniciadora 9 ativa a caspase 3 e toda a via a jusante desencadeando a apoptose. A mudança de potencial da membrana mitocondrial e a liberação do citocromo C são regulados pelas proteínas da família Bcl-2 encontradas na membrana externa da mitocôndria, algumas com função anti-apoptótica (Bcl-2, Bcl-xl ou Mcl-1) e outras pró-apoptótica (Bax, Bak ou Bik), são encontradas na membrana externa da mitocôndria (ADAMS & CORY, 1998). Segundo JOZA (2001), a via mitocondrial pode ocorrer também através da ativação do fator indutor da apoptose (AIF), que localiza-se entre as membranas interna e externa da mitocôndria e é liberado para o citoplasma após os sinais de morte. O AIF age independentemente das caspases, uma vez que alcança o núcleo e interage diretamente com o DNA, causando condensação e fragmentação deste, através da ativação de endonucleases (GESKE & GERSCHENSON, 2001).

A via grânulo-dependente é o meio efetor através do qual linfócitos T citotóxicos (CTL) e células NK eliminam células-alvo infectadas. O mecanismo envolve a introdução de granzima produzida pelas CTL e células NK, através de uma proteína com função de poro, a perfurina. As granzimas saltam o esquema convencional de ativação da cascata das caspases e ativa diretamente as caspases iniciadora 10 e efetoras 3 e 7 (THORNBERRY et al., 1997). A granzima pode também clivar diretamente fatores intranucleares, resultando em apoptose caspase- independente. Além disso, pode levar a liberação do citocromo C, ativando a via mitocondrial.

As três vias convergem para a ativação da caspase 3, que por sua vez ativa as caspases efetoras 6 e 7. A ativação das caspases efetoras 3, 6 e 7 resulta na clivagem de várias proteínas-alvo com função estrutural e regulatória no citosol e no núcleo, deste modo resultando em desmantelamento celular (THORNBERRY & LAZEBNIK, 1998). A poli (ADP-ribose) polimerase – PARP – é uma proteína nuclear envolvida nos mecanismos de reparo do DNA, sobrevivência celular, proliferação e diferenciação. A PARP representa um dos alvos principais das caspases efetoras 3,

6 e 7. A detecção através do Western Blot, de fragmentos da PARP é amplamente utilizada para revelar a apoptose em células, tecidos e órgãos (GOEBEL et al., 2001).

Outras enzimas importantes participam da apoptose: 1) a endonuclease endógena, presente no núcleo celular, é ativada pelos íons cálcio e magnésio e atua promovendo a fragmentação internucleossômica do DNA formando fragmentos de 180 a 200 pares de bases (ARENDS et al., 1991); 2) a transglutaminase promove a ligação cruzada entre proteínas citoplasmáticas e membrana celular, tendo como principal finalidade manter a integridade da membrana celular durante a formação dos corpos apoptóticos, impedindo a liberação do conteúdo intracelular para o interstício (ARENDS et al., 1991); 3) a enzima flipase fornece energia e promove a eversão da fosfatidilserina, facilitando o reconhecimento dos corpos apoptóticos pelos fagócitos. As caspases também atuam na eversão da fosfatidilserina (MARTIN, 1995; HACKER, 2000).

A apoptose participa de processos fisiológicos e patológicos. Dentre os primeiros, podemos destacar sua participação: 1) na embriogênese onde é utilizada como forma de suprimir estruturas embrionárias vestigiais (como na involução genital durante a diferenciação sexual de mamíferos) ou como meio de alcançar a forma adulta futura do organismo (como na formação dos dedos da mão humana onde as células que estão nos espaços interdigitais sofrem apoptose); 2) na renovação celular onde atua eliminando células indesejadas abrindo espaço para as células novas, assim promove o controle da população celular, ação contrária a da mitose (MEIER et al., 2000); 3) na regulação e funcionamento do sistema imune onde atua eliminando os linfócitos auto-reativos durante a diferenciação linfocitária e descartando os linfócitos antígenos-específicos no final de uma resposta imune (BAUMANN et al., 2002) e 4) como mecanismo efetor através do qual linfócitos T e células NK eliminam células-alvo infectadas na imunidade inata e adaptativa contra patógenos intracelulares (WILLIAMS, 1994; LILES, 1997). A apoptose pode ser considerada como importante marcador de resolução de inflamação e parece ser um dos principais responsáveis pelo privilégio imunológico no olho, cérebro e gônadas (FERGUSON & GRIFFITH, 2007).

Dentre os estados patológicos podemos destacar aqueles decorrentes do aumento da apoptose, como as doenças degenerativas, ou da diminuição da apoptose, como as doenças expansivas ((GAVRILESCU LC & DENKERS, 2003 a). A apoptose exerce também um papel crítico na regulação da resposta hospedeira durante infecção por vírus, bactérias e protozoários intracelulares (WILLIAMS, 1994; LILES, 1997). A apoptose também está envolvida na patogenia de várias doenças oculares tais como retinose pigmentar, glaucoma, uveítes, catarata e doenças da retina (FERGUSON & GRIFFITH, 2007).

No cristalino, normalmente a diferenciação celular é acompanhada de degeneração nuclear (MODAK et al., 1969, MODAK et al., 1970), similar à degradação oligonucleossomal (APPLEBY & MODAK, 1977) frequentemente descrita na apoptose (WILLIE et al., 1980). Apesar das mudanças, as células do cristalino persistem ao longo da vida do indivíduo, enquanto que as células apoptóticas são, normalmente, potentes gatilhos para fagocitose. Diferentemente também do que ocorre nas células apoptóticas que morrem randomicamente, a diferenciação das fibras cristalinianas seguem um padrão altamente ordenado de progressão temporal. Nos pacientes com catarata, no entanto, o sistema de defesa contra o estresse oxidativo e os raios ultravioleta parece ser deficiente o que leva a apoptose nas células epiteliais do cristalino e subseqüente opacificação lenticular (LI

et al., 1995).

O papel central da hipertensão intraocular na fisiopatologia do glaucoma vem sendo questionada desde que alguns pacientes apresentam perda progressiva de células ganglionares apesar da normalização da pressão ocular (BRUBAKER, 1996), além do que, um sexto dos pacientes que fazem lesão glaucomatosa não apresenta hipertensão ocular (LISEGANG, 1997). Existem evidências histológicas e eletrofisiológicas que demonstram que as células ganglionares são as únicas células acometidas. Vários fatores têm sido implicados na morte das células ganglionares, dentre eles a apoptose (KAUSHIK et al., 2009). Esta nova visão sobre o glaucoma tem levado a esforços em busca de uma terapêutica objetivando neuroproteção, além da tradicional terapia hipotensora.

A retinose pigmentar, um grupo de condições hereditárias envolvendo a morte de fotorreceptores, representa a causa mais prevalente de baixa acuidade visual na

população ativa de países desenvolvidos. A retinose pigmentar está relacionada com a perda de função e viabilidade dos bastonetes. A despeito da grande heterogeneidade de alterações genéticas que podem causar a retinose pigmentar, estudos em modelos experimentais em animais de pequeno porte indicam que a apoptose é uma via final comum de morte de células fotorreceptoras (PORTERA- CAILLIAU et al, 1994).

RAO et al. (2008) demonstraram não haver evidências de apoptose em fotorreceptores nas fases iniciais da uveíte autoimune experimental (EAU –

experimental autoimmune uveitis), apesar de a liberação de citocromo C para o

citosol estar aumentada. O estudo mostrou também que o nível de alfa A-cristalin aumenta trinta e três vezes no segmento externo dos fotorreceptores e parece proteger estas células contra a apoptose induzida pelo estresse oxidativo da mitocôndria.

Células imunocompetentes ativadas são deletadas por apoptose após a fase aguda da inflamação em diversas doenças, mas na doença de Behçet a inflamação persiste. NAKAMURA et al (1996) mostraram que nesta doença os pacientes com uveorretinite ativa apresentam expressão diminuída de Fas em células T CD4+ e alta expressão nas células T CD8+ se comparados aos pacientes sem uveorretinite ativa e aos controles sem a doença, o que sugere que células T CD4+ ativadas com expressão deficiente de Fas, ou seja que não são deletadas por apoptose, podem ser as responsáveis pela inflamação crônica severa.

No documento Alterações morfométricas na retina de camundongos C57BL/6 infectados com Toxoplasma gondii e pesquisa de apoptose (páginas 39-48)