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Tratamento com Ácido Clorídrico Deuterado:

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Tratamento com Ácido Clorídrico Deuterado:

Quando submetida ao tratamento inicial DCl 0,1 M diluído em água deuterada sob refluxo por 12 horas, a molécula de rosuvastatina foi degradada muito além dos 30% máximos almejados, o que foi percebido através de análises de espectros de RMN de

1H e 19F como demonstram as Figuras 21 e 22. No espectro de RMN de 1H observam-

se na ampliação da região de H19 e H20 da RV os sinais de no mínimo dois compostos em aproximadamente igual proporção, isso também é observado nos dois sinais de intensidades aproximadas no espectro de RMN de 19F que também apresenta vários outros sinais de pequena intensidade.

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Figura 21 - Espectro de RMN de 1H da amostra após degradação com DCl 0,1 M/12 h, sob refluxo. Eclipse da ampliação da região de H19 e H20 da rosuvastatina (RV) e

produto de degradação (PD) (Em DMSO-d6 a 400,13 MHz).

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm PC 1.00 GB 0 LB 0 Hz SSB 0 WDW EM SF 400.1800000 MHz SI 131072 F2 - Processing parameters PLW1 15.00000000 W P1 8.40 usec NUC1 1H SFO1 400.1821075 MHz ======== CHANNEL f1 ======== TD0 1 D1 1.00000000 sec TE 295.3 K DE 10.00 usec DW 109.200 usec RG 32 AQ 7.1565814 sec FIDRES 0.069866 Hz SWH 4578.754 Hz DS 0 NS 16 SOLVENT DMSO TD 65536 PULPROG zg30 PROBHD 5 mm TBI 1H/13 INSTRUM spect Time 16.36 Date_ 20120905 F2 - Acquisition Parameters PROCNO 1 EXPNO 1 NAME ANA_DCl_0-1M_ppt_DMSO_12h_05-09-12 Current Data Parameters

H19 RV e PD H20 RV e PD 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 16 17 N N H3C CH3 N F H3C S O O CH3 OH OH OH O

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Figura 22 - Espectro de RMN de 19F da amostra após degradação com DCl 0,1 M/12 h,

sob refluxo. (Em DMSO-d6 a 600,17 MHz).

Este excesso de degradação dificulta a interpretação e cria possíveis produtos de degradação secundários. Então, as condições de reação foram amenizadas até que se obtivesse uma concentração de aproximadamente 10% de degradação. Assim ficou definido o tratamento com DCl 0,01 M diluído em água deuterada sob refluxo por 3 horas, através da análises dos espectros de RMN de 1H e 19F das Figuras 23 e 24

respectivamente.

A Figura 23 compara a região do espectro onde se encontra o sinal de H7 da molécula de rosuvastatina na amostra sem degradação com a mesma região do espectro após a degradação em DCl 0,01 M, sob refluxo por 3 horas. Um sinal em 6,72 ppm pertencente ao produto de degradação (PD) foi integrado em relação ao sinal de H7 da molécula de RV em 6,49 ppm. Foi escolhida essa região do espectro, porque

-109 -110 -111 -112 -113 ppm PC 1.00 GB 0 LB 0.30 Hz SSB 0 WDW EM SF 564.7240260 MHz SI 65536 F2 - Processing parameters SFO2 600.1724007 MHz PLW12 1.46940005 W PLW2 32.00000000 W PCPD2 70.00 usec NUC2 1H CPDPRG2 waltz16 ======== CHANNEL f2 ======== SFO1 564.6627792 MHz PLW1 64.00000000 W P1 25.00 usec NUC1 19F ======== CHANNEL f1 ======== TD0 1 D12 0.00002000 sec D11 0.03000000 sec D1 1.00000000 sec TE 298.4 K DE 6.50 usec DW 25.000 usec RG 181 AQ 0.8192500 sec FIDRES 0.610352 Hz SWH 20000.000 Hz DS 0 NS 128 SOLVENT DMSO TD 32768 PULPROG zgfhigqn.2 PROBHD 5 mm PATBO BB- INSTRUM spect Time 19.31 Date_ 20111220 F2 - Acquisition Parameters PROCNO 1 EXPNO 5 NAME ANA_19F_ppt_01M_12H_DCl_DMSO Current Data Parameters

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esse dois sinais estão bem separados possibilitando uma boa integração. Também foram integrados os sinais referentes ao átomo de flúor na molécula de RV e do PD que aparenta ser único, ou majoritário, como mostra a Figura 24.

Figura 23 - Expansão do espectro de RMN de 1H da região de H7 da molécula de rosuvastatina. Superior: amostra íntegra em DMSO-d6 a 400,13 MHz. Inferior: após

degradação com DCl 0,01M/3h, sob refluxo (Em DMSO-d6 a 600,17 MHz).

6.35 6.40 6.45 6.50 6.55 6.60 6.65 6.70 6.75 6.80 ppm 93 .3 1 6. 70

H7 RV

H7 PD

1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 16 17 N N H3C CH3 N F H3C S O O CH3 OH OH OH O

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Figura 24 - Espectros de RMN de 19F com a integração dos sinais da amostra após degradação com DCl 0,01 M/3 h, sob refluxo. (Em DMSO-d6 a 470,34 MHz).

Os espectros de RMN de 1H e 19F (Figura 23 e 24) da amostra após a degradação com DCl 0,01M sob refluxo por 3 horas revelam diferentes porcentagens de produto de degradação (6,70 e 9,53% respectivamente). Um dos motivos prováveis é que amostras foram preparadas em diferentes ocasiões para cada tipo de análise e a metodologia de preparo não foi validada. Outra hipótese para explicar a diferença é que por tratar-se de ensaios qualitativos, não foram realizadas medidas de relaxação longitudinal (T1). Dessa forma, a integração dos sinais foi útil apenas para nortear a

intensidade da degradação de cada tratamento.

As Figuras 25 e 26 mostram em espectros de RMN de 1H e 13C,

respectivamente, regiões de sobreposição ou de deslocamentos químicos muito

-80 -90 -100 -110 -120 -130 ppm 90 .4 7 9. 53 -110 -112 -114 ppm 90 .4 7 9. 53

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semelhantes entre os sinais das moléculas de RV e PD que dificultam a elucidação de

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Figura 25 - Espectro de RMN 1H de RV em DCl 0,01 M, sob refluxo/3h com expansões de regiões de sinais sobrepostos. (Em DMSO-d6 a 400,13 MHz).

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Figura 26 - Espectro de RMN 13C de RV em DCl 0,01 M, sob refluxo/3h com expansões de regiões de sinais de PD

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Na tentativa de resolver a sobreposição de sinais do espectro de RMN de

1H, optou-se pela realização de experimentos TOCSY-seletivo.

Os subespectros para Rosuvastatina e para o produto de degradação em meio ácido dos experimentos de TOCSY seletivo e a estruturas atribuídas estão nas Figuras 27 e 28.

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Figura 27 - Espectro superior: RMN de 1H da RV após DCl 0,01 M, sob refluxo/3h.

Subespectros a-g: TOCSY seletivos da RV com irradiação dos hidrogênios descritos na

estrutura molecular. (Em DMSO-d6 a 400,13 MHz).

1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 16 17 N N H3C CH3 N F H3C S O O CH3 OH OH OH O Irradiando em a) H11 e 12; b) H4; c,d) H2; e) H10, f) H3; g) H17;

h) Soma dos espectros com irradiação seletiva nos sinais.

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Figura 28 - Espectro superior: RMN de 1H da RV após DCl 0,01 M, sob refluxo/3h. Subespectros a-i: TOCSY seletivos do PD com irradiação dos hidrogênios

descritos na estrutura molecular (Em DMSO-d6 a 400,13 MHz)..

Foram realizados experimentos de HMBC 1H-13C para auxiliar na atribuição dos sinais dos espectros da própria rosuvastatina e depois do produto de

Irradiando em a) H11 e 12; b) H4; c) H2; d) H10, e) H3; f) H17; g) H6; h) H7; i) H17; j) Soma dos espectros com irradiação seletiva

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degradação em meio ácido. No caso deste estudo onde a concentração do produto de degradação formado é monitorada, é muito simples saber quais são os sinais que pertencem a rosuvastatina ou ao produto de degradação. Entretanto, em misturas de compostos de concentrações semelhantes, o espectro bidimensional é importante para discernir a origem dos sinais. Mesmo usando esse artifício, quando há misturas de compostos de estrutura relativamente semelhantes, como é o caso da rosuvastatina e da lactona, produto de degradação em meio ácido, as correlações de um espectro de 2D podem ser largas e faltar resolução entre elas para uma atribuição inequívoca dos pares de núcleos. Pode ser observado na Figura 29 a grande utilidade de um espectro de RMN de 2D HMBC e suas limitações. Na expansão à direita as correlações dos carbonos com o hidrogênio H7 apresentam resolução suficiente para determinação da maioria de seus deslocamentos químicos. Então é possível verificar quais são as correlações da rosuvastina e da lactona. No entanto, como se vê na expansão à esquerda, os carbonos C13, C14 e C9 têm seus deslocamentos e suas correlações muito próximas em relação à rosuvastatina e à lactona e por isso não podem ter seus deslocamentos químicos distintos. No caso da expansão apresentada em verde, o deslocamento químico de C17, C16, C15 e C18 da rosuvastatina e da lactona têm deslocamentos químicos extremamente parecidos, bem como de H17 e H16, de forma que as correlações ficam completamente sobrepostas.

66 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 16 17 N N H3C CH3 N F H3C S O O CH3 OH OH OH O rosuvastatina lactona

Figura 29 - Espectro de RMN de 2D HMBC 1H-13C de RV em DCl 0,01 M, sob

refluxo/3h com expansões de regiões de correlações sobrepostas (à esquerda) e com resolução suficiente para atribuição do deslocamento químico (à direita).

Um exemplo do chamado folding é exposto na Figura 30. Embora a resolução seja bem maior quando se diminui a janela espectral, apenas duas correlações representam a frequência correta na dimensão do 13C no espectro com janela espectral de 40 ppm, o que fica evidente quando ele é sobreposto a um espectro de janela espectral de 180 ppm na dimensão do 13C. Observa-se que apenas as correlações apontadas pelas setas coincidem em ambos espectros,

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devido ao fato de pertencerem a um único carbono com deslocamento químico de 115,5 ppm, frequência esta que se encontra dentro da faixa espectral mais estreita (cor rosa).

Figura 30 - Dois espectros de RMN de 2D HMBC 1H-13C de RV em DCl 0,01 M,

sob refluxo/3h sobrepostos. Para ambos a mesma janela espectral na dimensão do 1H. Espectro adquirido com janela espectral de 180 ppm, com centro em 100 ppm e resolução de 35,37 Hz, sobreposto com a imagem (retângulo rosa) do espectro adquirido com janela espectral de 40 ppm, com centro em 100 ppm e resolução de 7,86 Hz. As setas apontam para as únicas correlações de frequência

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Os experimentos de HMBC neste trabalho usaram gradiente de campo pulsado (PFG) e com o objetivo de aperfeiçoamento no uso de experimentos seletivos para estudos de degradação, foram implementadas sequências de pulsos que usam tempo constante de evolução.

A Figura 31 demonstra a melhoria na resolução dos sinais no domínio F1

em um experimento de HMBC Constant Time (CT-HMBC) em relação a um HMBC, através das larguras das linhas nas projeções de 13C dos espectros.

Figura 31 - Projeções dos domínios de 13C: Sinais largos: Espectros de RMN de 2D HMBC 1H-13C. Sinais finos: CT- Espectros de RMN de 2D HMBC 1H-13C.

As Figuras 31 e 32 representam um exemplo das melhorias substanciais, em termos de elucidação, que podem ser obtidas com esse tipo de experimento em que o espectro fica mais “limpo” melhorando a identificação das correlações. Os espectros dos experimentos seletivos estão sobrepostos ao HMBC 1H-13C

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(maiores correlações) e deslocados à direita, conforme explicam as legendas, para melhor visualização das correlações. Deve-se atentar para o fato de que a amostragem do experimento CT-HMBC da Figura 33 é o dobro do executado no experimento CT-HMBC da Figura 32. Em um experimento seletivo sem o tempo constante de evolução, isso deveria ocasionar maior inclinação das correlações, pois foi aumentado o tempo de aquisição de 0,047 para 0,256 segundos, aumento esse que se deve a diminuição da janela espectral, além do aumento da amostragem em busca da maior resolução obtida.

Figura 32 – Espectros de RMN de 2D: HMBC 1H-13C, na dimensão do 13C: TD

128, SW 220ppm, O2P 110ppm, Resolução 259,4 Hz. NS 2.

Deslocado em 0,089 ppm à direita (em rosa) - sel-HMBC 1H-13C, na dimensão do

13C: TD 128, SW 9ppm, O2P 163ppm, Resolução 10,6 Hz. NS 2. Deslocado em

0,1433 ppm à direita (em azul): sel- HMBC 1H-13C.Constant Time, na dimensão do

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Figura 33 - Espectros de RMN de 2D: HMBC 1H-13C, na dimensão do 13C: TD 128, SW 220ppm, O2P 110ppm, Resolução 259,4 Hz. NS 2.

Deslocado em 0,0889 ppm à direta à (em rosa): sel-HMBC 1H-13C, na dimensão do 13C: TD 128, SW 9ppm, O2P 163ppm, Resolução 10,6 Hz. NS 2. Espectro deslocado em 0,1672 ppm à direita (em azul): sel- HMBC 1H-13C

Constant Time, na dimensão do 13C: TD 256, SW 3.31ppm, O2P 163ppm,

Resolução 10,6 Hz. NS 16.

Através das técnicas seletivas de TOCSY e HMBC 1H-13C foi possível a

elucidação estrutural de uma lactona (PD), além da própria molécula de RV após o tratamento ácido, devido ao processo de esterificação proposto na Figura 34.

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Os dados obtidos por RMN estão de acordo com o espectro de massas obtido na Figura 35. É observada tanto em modo positivo, quanto negativo a perda de uma molécula de água, o que determina a esterificação da rosuvastatina em lactona.

Figura 35 - Espectro de massas com ionização por electrospray. Superior: ESI

modo positivo com destaque para a forma protonada, para os correspondentes adutos de sódio e de potássio, e para a perda de uma molécula de água. Inferior:

ESI modo negativo com destaque para a forma deprotonada e para a perda de uma molécula de água.

Os resultados obtidos no estudo da degradação da rosuvastatina em meio ácido também são condizentes com dados literários. Um trabalho realizado por

Hoffmann e Nowosielski37 estudou a interconversão da molécula de atorvastatina

em sua respectiva lactona em meio ácido. Apesar de não se tratar do mesmo fármaco estudado nesse trabalho, a atorvastatina e a fluvastatina (Figura 36) também pertencem à família das estatinas e têm estruturas extremamente semelhantes à rosuvastatina, principalmente no que diz respeito à parte 3,5-diol, presente em ambas, e determinantes na reação de esterificação.

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Figura 36 - Estruturas moleculares da atorvastatina (esquerda) e fluvastatina

(direita).

Em pH fisiológico, ou mais alto, a lactona é instável e o equilíbrio favorece a hidrólise, com abertura da lactona prevalecendo a forma hidroxiácido. Entretanto,

in vivo, as estatinas existem em equilíbrio e para algumas delas, a forma lactona é

tão abundante quanto à forma hidroxiácido. O mecanismo da interconversão lactona-hidroxiácido da fluvastatina que um fármaco da família das estatinas também com estrutura molecular semelhante à rosuvastatina, foi estudado teoricamente através de métodos DFT (Density Functional Theory) em meio básico e ácido. Foi calculado que para condições básicas a energia de ativação para reação de hidrólise (9 kcal mol-1) é bem menor que do que a energia de ativação da reação inversa ou esterificação (28 kcal mol-1), levando à instabilidade dessa última forma. Em meio ácido as energias de ativação de ambos os sentidos da reação têm valores comparáveis (22 kcal mol-1 para a hidrólise e 28 kcal mol-1 para a lactonização) tornando provável a existência das duas formas.37

Segundo a Agência de Medicina Europeia a forma lactônica de rosuvastatina não tem atividade farmacológica. Por isso é tão importante a análise deste produto de degradação no medicamento.38

A degradação forçada de Rosuvastatina em meio ácido resultando na formação da respectiva lactona já havia sido publicada.39 Isto está em concordância ao fato de que ácidos carboxílicos reagem rapidamente com alcoóis sob catálise ácida levando à formação de ésteres, em uma reação onde o nucleófilo é o oxigênio da hidroxila. -Hidroxiácidos, como é o caso da rosuvastatina, ciclizam-se formando as lactonas correspondentes. Não deve haver formação de dímeros, pois o processo intramolecular é entropicamente favorecido.

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Em meio aquoso diluído, a reação no sentido da hidrólise é favorecida, enquanto o meio mais fortemente ácido favorece a esterificação.40

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