Western blot

3.2.7.1 Extração e Homogeneização dos Tecidos

Após as 8 semanas de treinamento, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Os rins e músculos esqueléticos (tibial anterior) foram rapidamente removidos. Os tecidos foram extraídos e homogeneizados por 15 segundos em Politron. Em seguida, as amostras foram colocadas em uma solução de Triton 10% por 40 minutos. Após esse tempo, as amostras foram centrifugadas a 4°C, durante 40 minutos a 12000 rpm. O sobrenadante foi retirado e dividido em duas alíquotas. Na primeira foi realizada a quantificação das proteínas pelo método de biureto. Para isso foi adicionado 20 L da amostra, 1 mL do reagente de biureto e feita a leitura em espectrofotômetro a 540 nm. Na segunda alíquota foi adicionado 100 L de Laemli (antifúngico) e 0,015 de DTT para armazenamento e conservação das amostras congeladas em freezer (-80 °C) para posterior análise de western blot.

3.2.7.2 Corrida, Transferência e Revelação de Amostras Teciduais

Para as análises pela técnica de western blot foram preparados géis de poliacrilamida cuja concentração dependia da massa das proteínas estudadas. Antes da aplicação da proteína no gel, o extrato total foi aquecido a 95°C, em banho- maria, por 5 minutos. Após o aquecimento foi aplicado no gel 7 microlitros do marcador (amostra padrão). Posteriormente, aplicou-se as amostras em cada poço de gel. A eletroforese foi realizada em cuba de minigel da BioRad (Mini-Protein), com solução tampão para eletroforese, previamente diluída. O SDS-PAGE foi submetido a 40 volts, inicialmente, até a passagem da linha demarcada pela fase de empilhamento (stacking) e 120 volts até o final do gel de resolução (resolving). As proteínas separadas no SDS-PAGE foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, utilizando-se o equipamento de eletro-transferência de minigel da BioRad. A solução tampão de transferência foi mantida em voltagem constante de 120 volts por 2 horas, sob refrigeração continua com gelo. Após a transferência, a membrana foi retirada e para cada uma acrescentou-se uma solução bloqueadora (10 mL de solução basal + 0,5 g de leite em pó desnatado Molico) e procedeu-se agitação no rocker por 2 horas. Passado o tempo do bloqueio, as membranas ficaram imersas por 10 minutos em solução basal dentro de um agitador rocker com posterior descarte da solução. Esse procedimento foi repetido por 3 vezes para completa limpeza. Após as lavagens, preparou-se de 10 mL de solução basal + 0,3 g de albumina para cada membrana. Nessa preparação pipetou-se 10 microlitros do anticorpo a ser estudado e foi deixado no rocker a 4 °C overnight para completa ligação do anticorpo primário nas amostras. Na manhã seguinte, novamente lavou- se cada membrana por 3 vezes com solução basal para limpar os resquícios do anticorpo primário. A seguir, preparou-se uma solução com 10 mL de solução basal + 0,3 g de leite em pó desnatado molico + 1,8 L de anticorpo secundário ligado a peroxidase e deixados no agitador rocker por 2 horas. Por último, lavou-se novamente cada membrana por 3 vezes com solução basal para limpar os resquícios do anticorpo secundário. Para a revelação das membranas foi utilizado um kit de quimiluminescência Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate da marca Thermo Scientific (número de catálogo 33080; lote JH 126930). O anticorpo IR de músculo esquelético foi revelado por filme, e foi revelado em solução reveladora e fixadora (revelador manual, marca Brafox; lote 704161). Os anticorpos

IRS-1, Akt e GLUT-4 de músculo esquelético e AT1R e AT2R foi revelado pelo

mesmo procedimento de quimiluminescência, no entanto, o equipamento utilizado foi ImageQuant LAS 4000 GE Healthcare Life Sciences.

Em relação aos anticorpos, para os receptores AT1R e AT2R foi utilizado o

anticorpo rabbit polyclonal sc-7229 marca Santa Cruz Biotechonolgy, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Os anticorpos secundários utilizados foram Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA, USA). Os anticorpos utilizados nas análises de músculo foram IR, rabbit polyclonal sc-20739 marca Santa Cruz Biotechonolgy, Inc. (Santa Cruz, CA, USA), IRS-1 rabbit polyclonal sc-175091-AP marca Protein Tech, Akt-1 rabbit sc 2938, marca Cell Signaling e GLU-4 rabbit NBP1 49533, marca Novus Biologicals.

3.2.8 Perfusão

3.2.8.1 Eutanásia e Perfusão

Parte dos animais foram anestesiados com cloridrato de ketamina (50mg/kg) e cloridrato de xilasina (1mg/kg) por via intraperitoneal. Após a anestesia, foi realizada a abertura da região abdominal até a região do tórax, com afastamento das costelas e exposição do coração. Foi inserido um cateter acoplado a um sistema de perfusão Masterflex® (Cole-Parmer®, EUA) no ventrículo esquerdo e um pequeno corte foi realizado no átrio direito, para impedir aumento excessivo da pressão no sistema circulatório e possibilitar o extravasamento dos líquidos. Inicialmente foi feita a perfusão de solução salina heparinizados por todos os órgãos do animal e em seguida, de solução de paraformaldeído tamponado em tampão fosfato a 4%, pH7,4 para a fixação dos órgãos. Posteriormente, foi realizada a coleta do coração do animal, e a dissecção do ventrículo esquerdo, que foi armazenado para a análise histológica e imunohistoquímica.

3.2.8.2 Processamento histológico e morfometria ovariana

Os ovários dos animais que foram perfundidos com solução salina e solução de paraformaldeído 4% no momento da eutanásia permaneceram em solução de paraformaldeído 4% por 2 horas. Em seguida foram lavados sob água

corrente por 1 hora e armazenados em álcool 70°. Posteriormente, o material foi desidratado em soluções com concentração crescente de álcool (80%, 90%, 95% e 100%), diafanizado em xilol e embebido em paraplast (Sigma-Aldrich®) para a inclusão e formação dos blocos. Os blocos foram então seccionados em cortes histológicos sem seriados de 5µm de espessura que foram produzidos em micrótomo rotativo, que foram posicionados em lâminas previamente tratadas com solução de triethoxyl-silane (Sigma-Aldrich®). As lâminas foram então levadas à estufa à 60°C por 12 horas. As lâminas contendo os cortes histológicos foram desparafinizadas (banhos de xilol e álcool-xilol) e hidratadas (banhos em soluções com concentração decrescente de álcool e água destilada). Posteriormente, foram então coradas com solução de hematoxilina – eosina (HE) para a mensuração das áreas de secção transversa dos ovários. A descrição metodológica da técnica HE encontra-se no Anexo 4. Para a aferição das áreas da secção transversa dos ovários foram feitas diversas imagens digitais em aumento de 40 vezes utilizando-se o microscópio Olympus BX51 acoplado a câmera de vídeo. Estas imagens foram analisadas com o programa de análise de imagens Image J. Foram mensuradas aproximadamente 50 células por lâmina analisada (130). Os ovários selecionados que foram seccionados transversalmente apresentavam forma arredondada, núcleo visível no centro da célula e estavam localizados na camada subendocárdica da parede muscular do ventrículo esquerdo. A média das áreas seccionadas foram utilizadas como indicador do tamanho celular. As lâminas foram digitalizadas em scanner e, com o auxílio do Programa Image J, foi obtida a área ovariana a cada 30 µm. Para obtenção da área total dos ovários, os valores obtidos para cada ovário foram somados e divididos pelo número de cortes.