Lösung und in Kombination mit Lateral Flow Tests

Neben Schwangerschaftstests zu Hause als bekanntestem Beispiel werden inzwischen in vielen Bereichen Lateral-Flow-Tests eingesetzt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die präparierten DNA-Gold-Nanopartikel mittels Lateral-Flow-Assays auf ihre Eignung für den Einsatz getestet. Im zweiten Teil dieser Studie ging es um die Nützlichkeit der DNA-Gold-Nanopartikel.

EINLEITUNG

Verwendungszweck, Synthese und besondere Eigenschaften von (Gold)nanopartikel

• Warum Nanopartikel in der Molekularen Diagnostik ?
• Allgemeine Herstellung von NP
• Einzelne Schritte der Synthese mit Hilfe der Turkevich-Frens-Methode
• Stabilität von GNP
• GNP als optische Signalgeber
• Qualitative Überprüfung und quantitative Bestimmung von GNP

Dieses Verfahren wird als Turkevich-Frens-Methode [6] bezeichnet und ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur BSP-Produktion. Beispielsweise gab es erfolgreiche Versuche, Ascorbinsäure [7] oder die Aminosäure Tryptophan [8] zur BSP-Produktion zu nutzen. Bei der Synthese von GNP werden einige Farbveränderungen beobachtet, die Rückschlüsse auf die entsprechende geometrische Form des Produkts zulassen.

Modifizierte GNP

• Selbstanlagernde Monoschichten an Goldoberflächen
• Erste Versuche
• Charakteristik der Au-S Bindung
• Nicht Au-S Bindungen
• Einsatz von DNA-GNP in der Bioanalytik
• Anwendung von DNA als Klebstoff in der GNP-Bioanalytik
• Funktionalisierung von Oligonukleotiden an GNP mit Hilfe der Au-SH Bindung
• Wechselwirkungen zwischen unmodifizierter DNA und GNP
• Praktische Durchführung der Funktionalisierung und Optimierungsstrategien
• Zusätzliche Stabilisierung der DNA-GNP
• Veränderte Eigenschaften der DNA- DNA Hybridisierung durch die Konjugierung mit GNP
• Hybridierungszusätze

Ein wichtiger Schritt zur Entwicklung hochwertiger DNA-GNP ist eine reproduzierbare Bindung der Oligonukleotide an die Au-Oberfläche. Der Zusatz von Stabilisatoren zur Verhinderung einer unerwünschten Aggregation von DNA-GNP hat sich als sehr wirksam erwiesen. Eine bemerkenswerte Eigenschaft von DNA-GNP ist das veränderte Schmelzverhalten zwischen zwei miteinander hybridisierten DNA-GNPs.

Lateral Flow Tests kombiniert mit DNA-GNP

• Einleitung
• Verwendung von funktionalisierten GNP für den Nachweis von Biomolekülen in Lateral Flow Test s
• Lateral Flow Immunoassays
• Nucleic Acid Lateral Flow Immunoassay
• Nucleic Acid Lateral Flow Assay
• Bestandteile eines LFD-Streifen
• Aufgabezone
• Conjugate-Pad
• Membran
• Absorbent-Pad

Die meisten Tests basieren einfach auf der Verwendung von GNP-Protein-Konjugaten und werden als Lateral-Flow-Immunoassay (LFIA) bezeichnet. Links: Analyt (Antigen) und Signalgeneratoren (GNP-AK-Konjugat) werden am unteren Rand des LFD-Streifens gesammelt. Rechts: CL (bestehend aus Antikörpern), das an der Membran fixiert ist, fängt den Analyten spezifisch ein.

Gut etabliert sind auch Assays, die Proteine ​​als Biokonjugate für BNP verwenden, aber immer noch zum Nachweis von DNA verwendet werden [66–70]. Der große Fortschritt bei der Entwicklung von DNA-BNP hat zur Entwicklung von LFDs geführt, die keine Proteinkonjugate erfordern [71–78]. Für eine stabilere Fixierung der als CL fungierenden Oligonukleotide auf der Membran kann diese mit Streptavidin (STV) behandelt werden [71].

Oder DNA wird komplett als CL weggelassen und stattdessen nur STV verwendet [72]. Neben dem spezifischen Nachweis von DNA-Sequenzen können DNA-GNPs auch andere Substanzen wie Schwermetalle nachweisen [79]. Links: DNA-GNP und die nachzuweisende DNA-Sequenz befinden sich am unteren Rand des Teststreifens.

Die Unterschiede bei der Membran liegen meist nur in der Wahl der Porengröße.

ZIEL DER ARBEIT

MATERIAL UND METHODEN

• Allgemein verwendete Geräte und Materialien
• Puffer und Stocklösungen
• DNA und Streptavidin-Verdünnungspuffer
• Phosphatpuffer (Stocklösung)
• NaCl-Lösung (Stocklösung)
• LFD-Laufpuffer bzw. Puffer für Hybridisierungsansätze
• Vorbereitung kommerziell erhaltener Oligonukleotide und Streptavidin
• Synthese und Größenüberprüfung der hergestellten 13 nm Goldnanopartikel
• Herstellung von 13 nm Goldnanopartikel
• Bestimmung der Größe mittels UV-VIS-Spektroskopie
• Bestimmung der Größenverteilung mittels TEM
• Funktionalisierung von GNP mit SH-DNA
• Funktionalisierung der Goldnanopartikel
• Nachweis von gebundener DNA mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie
• Nachweis von gebundener DNA mittels quantitativer real-time-PCR
• Schmelzversuche von hybridisierten DNA-GNP
• Herstellung des Reaktionsansatzes
• Bestimmung des Schmelzbereiches
• Versuche mit Streptavidin-Streifen
• Aufbau der Streifen
• Sprayen von Streptavidin als Capture-Molekül
• Verwendete DNA-Konjugate als Testsysteme
• Hybridisierungsansatz für die Versuche an Teststreifen
• Durchführung der Testläufe und Auswertung

Die DNA wurde dann in einem Thermomixer bei 65 °C für 10 Minuten unter Schütteln (1400 U/min) gelöst und in einem Gefrierschrank bei -18 °C gelagert. Ausgehend von der Stammlösung (100 μmol/L) wurden Oligonukleotidsequenzen, die als Primer für die quantitative Echtzeit-PCR dienten, weiter 1:16 mit mit Diethyldicarbonat (Roth) behandeltem Wasser verdünnt und ebenfalls bei -18 °C gelagert. Grad. Für die Synthese von GNP wurden 100 ml einer 1 mM HAuCl-Lösung (Sigma-Aldrich) in einen 250 ml-Rundkolben überführt und unter einer Heizhaube zum Kochen gebracht.

Für die photometrische Messung wurde 1 ml der BNP-Lösung 1:4 mit UHQ-H2O verdünnt und die verdünnte Lösung in eine Kunststoffküvette (Roth) überführt. Insgesamt wurden TEM-Bilder aus drei verschiedenen Gruppen ausgewertet und der Durchschnittswert zur Bestimmung der Größenverteilung berechnet. Zur Stabilisierung wurden 10 µL einer 1 %igen SDS-Lösung zugegeben, gevortext und 5 Minuten bei Raumtemperatur belassen.

Dazu wurde das GNP 50 Minuten lang bei 9600 U/min zentrifugiert und der klare Überstand mit einem hohen Gehalt an freier DNA mit einer Pipette entfernt. Für die Membran wurden 2,5 cm einer Membranfolie zugeschnitten und gleichmäßig in der Mitte des Klebepads platziert. Vor dem eigentlichen Sprühvorgang wurde die Membran mit Magneten unter dem Sprühkopf fixiert und mit einer Konzentration von 0,667 µL/cm in die Mitte der 2,5 cm breiten Membran gesprüht.

Daraus ergeben sich insgesamt vier verschiedene Arten von DNA-GNPs, die während der STV-LFD-Teststreifenexperimente synthetisiert und verwendet wurden (Tabelle 5).

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Größenüberprüfung der Goldnanopartikel

• Bestimmung der Größe mittels UV-VIS-Spektroskopie
• Bestimmung der Größenverteilung mittels TEM

Überprüfung des Funktionalisierungserfolges

• Nachweis von gebundener DNA mittels TEM
• Nachweis von gebundener DNA mittels quantitativer real-time-PCR
• Vergleich zwischen DNA-Konzentration in der Endlösung und den Waschlösungen
• Bestimmung der Anzahl gebundener DNA auf einem GNP

Darüber hinaus ist in den Bildern des Instituts für Biophysik (BOKU, Wien) deutlich eine Art Grauschleier um das dunklere GNP zu erkennen. Dies bestätigt die Bindung der DNA an GNP, sagt aber nichts über die Art der Bindung aus. Dies ist einerseits wichtig, da sich freie DNA in der GNP-Lösung negativ auf einen späteren Nachweistest auswirken kann.

Die Ergebnisse der mittels PCR gemessenen DNA-Dichtebestimmung wurden mit der berechneten BNP-Konzentration pro PCR-Ansatz verglichen. Die GNP-Konzentration ergibt sich aus der Messung der Extinktion bei 520 nm unmittelbar vor der Herstellung des PCR-Ansatzes. Die berechnete DNA-Dichte pro BSP wich deutlich von der erwarteten Anzahl gebundener DNA ab.

Während Quantifizierungen mittels Fluoreszenzmessungen in der Größenordnung von etwa 150 SH-DNA-Molekülen/GNP liegen [82], ergab die PCR-Quantifizierung des selbstfunktionalisierten DNA-GNP theoretisch gebundene DNA-Partikel im einstelligen Bereich (Tabelle 7). Die Fluoreszenzmessung markierter DNA-Stränge ist die gebräuchlichste Methode zur Messung der DNA-Dichte am GNP. Als mit der Fluoreszenzmethode vergleichbar wurde eine Quantifizierungsmethode [83] beschrieben, die die Anzahl der DNA-Stränge mittels quantitativer Echtzeit-PCR analysiert.

Beispielsweise wurde im Gegensatz zur ursprünglichen Methode anstelle von Fluorescein SYBR Green I als Farbstoff verwendet.

Bestimmung des Schmelzbereiches der DNA-Goldnanopartikel

• Einfluss verschiedener Zusätze auf den Schmelzbereich
• Einfluss von Mismatches auf den Schmelzbereich

Auch beim Vergleich der DNA-BNP mit den beiden unterschiedlichen NaCl-Endkonzentrationen ist ein Trend erkennbar. Analog zum Hybridisierungsverhalten freier DNA wird die Schmelztemperatur des hybridisierten DNA-GNP durch die Konzentration an gelöstem NaCl beeinflusst (Abbildung 31). Neben der NaCl-Konzentration wurde im Rahmen dieser Arbeit auch der Einfluss verschiedener Zusätze auf das Schmelzverhalten des DNA-BNP untersucht (Abbildung 32).

Ihn interessierte, ob bestimmte Zusatzstoffe den Schmelzpunkt deutlich senken, erhöhen oder verengen können. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Dimethylsulfoxid (DMSO) in höheren Konzentrationen (10 %) den Schmelzpunkt senkt. Im Gegensatz zu den Hybridisierungsreaktionen unmodifizierter Oligonukleotide erwies sich der DNA-GNP-Schmelzpunkt als nicht so einfach zu berechnen.

M2LinkerMism.1 GAG GTTTTA TTA TTG TTAAAT ATT GAT AATTT GATT 45,5 M2LinkerMism.2 GAG GGCCCC TTA TTG TTAAAT ATT GAT ACCCG GATC 46,5 M2LinkerMism.3 TTTTAG GAAAAA TTA TTG TTAAAT ATT AAAAT AAG TA TTTAT 33,0 M2L inkerMism.4 M2LinkerMism GGA TGGGGA TTG TTAAAGGG ATT GAT ACG CCCG GAT 59,0 M2LinkerMism.5 GAG GAAAAA TTA TTG TCCCCAAACCC ATT GAT AAG AC AAAAT 44,0 M2LinkerMism.6 GAAAAA GTTTTA TTA TTTTTT TTAAAT ATT TTTTAT AAAAA TA TTATT 46,0 M2 LinkerMism.7 GCCCG GGA CC CCTA TTG GC GGGTAAAGGGG ATGGG GAT AAG GCG CCTC 35,5 M2LinkerMism.8 GCCCG GGA GC GGTA TTTG TTT TTAACCCCT ATT GAT AAAAA TA TTATT 44,5. M2LinkerMism.14 GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG TGCTGCTGCTGC 52,0 M2LinkerMism.15 TTTTAG GAAAAA TTA TTG TTAAAT ATT GAT AAG GAT 45,5. M2LinkerMism.20 GCCCG GGA CC CCTA TTG GC GGGTAAAT ATT GAT AAG GAT 45,0 M2LinkerMism.21 GCCCG GGA CC CCTA TTTC TTT TTAAAT ATT GAT AAG GAT 25,0 M2LinkerMism.22 GAG GGA TTA TTG TTAAAGGGG ATGGG GAT AAG G CG CCTC 49,5 M2LinkerMism.23 GAG GGA TTA TTG TTAACCCCT ATT GAT AAAAA TA TTATT 42,0.

Versuche mit Streptavidin-Teststreifen

• Versuch A – Realisierbarkeit des 3K-Aufbaus
• Versuch B – Benötigte Zeit für die Hybridisierung
• Versuch C - Mobilität der DNA-GNP entlang der NC-Membran
• Versuch D - Einfluss der Umgebungstemperatur auf das Testergebnis
• Versuch E – Linker mit eingebauten Mismatches als DNA-Modifikation
• Versuch F - Systematische Verkürzungen der M1 Linker bzw. M2 Linker
• Versuch G – Verdünnung des gesamten Reaktionsansatzes
• Versuch H – Systematische Verdünnung der Linker und Biotin-DNA
• Versuch I –Linker und Biotin-DNA jeweils unterschiedlich stark verdünnt
• Versuch J –Realisierbarkeit des 2-Komponenten-Aufbaus
• Versuch K- Systematische Verdünnung der Biotin-Linker

Die für Kapitel 4.3.2 designten DNA-Linker mit ingebtetten Mismatches erressetten in dieser Versuchsreihe die originale M2-Linker-DNA. M2LinkerMism.1 GAG GTTTA TTA TTG TTAT AAT ATT GAT AATTTT GAT + M2LinkerMism.2 GAG GGCCC TTA TTG TTAC AAT ATT GAT ACCCCG GAT + M2LinkerMism.3 TTTTAG GAAAA TTA TTG TTAA AAT ATT AAAAAT AAG TTTATT + M2LinkerMism.4 GCCCG GGA TGC GGA TTG TTAG AAGGGG ATT GAT ACCCG GATC + M2LinkerMism.5 GAG GAAAAA TTA TTG TCCCAC AACCCC ATT GAT AAG AAAATA + M2LinkerMism.6 GAAAAA GTTTTA TTA TTTTTT TTAAAT ATT TTTTAT AAAAAA TTTTAT + M2LinkerMism.7 GCCCCG GGA CCCCTA TTG GGG OZNAKA AAGGGG ATGGGG GAT AAG GCCCCT + M2LinkerMism. 8 GCCCCG GGA GGGGTA TTTTTT TTAACCCT ATT GAT AAAC AAA TTTTAT. M2LinkerMism.13 GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG GGGGCGCCC + M2LinkerMism.14 GAG GGA TTA TTG TTA AAT ATT GAT AAG TGTGTGCTGCCC + M2LinkerMism.15 TTTTAG GAAAA TTA TTG TTAA AAT ATT GAT AAG GAT.

M2LinkerMism.20 GCCCCG GGA CCCCTA TTG GGGTAG AAT ATT GAT GAT AAG GAT + M2LinkerMism.21 GCCCCG GGA CCCCTA TTTTTT TTAAAT ATT GAT GAT AAG GAT + M2LinkerMism.22 GAG GGA TTAGGGGCCGATTGATG ism.23 GAG GGA TTA TTG TT AACCCT ATT GAT AAAC AAA TTTTAT. Wenn die Bindungs-DNA und die Biotin-DNA gleichzeitig verdünnt wurden, konnte eine sichtbare Testlinie bei einer Verdünnung von fast dem Faktor 20.000 erzeugt werden (Abbildung 35). Dies entspricht einer Konzentration von 0,5 nM M1-bindender DNA oder M1-3̍-Biotin-DNA in 20 µL der Testmischung.

Eine zusätzliche Variation der DNA-GNP-Konzentration (rote Farbe) innerhalb der drei angewendeten Verdünnungsstufen hatte keinen Einfluss auf die erforderliche Konzentration an Linker- und Biotin-DNA (Tabelle 17). Um die Komponente zu finden, die hinsichtlich des Verdünnungsgrades einen limitierenden Einfluss auf ein positives Ergebnis hat, wurden die Bindungs-DNA und die Biotin-DNA jeweils in unterschiedlichen Anteilen verdünnt. Das Experiment zeigte, dass auch bei einer Verdünnung der Biotin-DNA um den Faktor 104 ein positives Ergebnis beobachtet werden kann (Tabelle 18).

Angesichts der Ergebnisse von Experiment I kann man jedoch die Hypothese aufstellen, dass die Hybridisierung zwischen DNA-GNP, das mehrere ssDNA-Stränge trägt, und der Linker-DNA aus thermodynamischer Sicht problematischer ist und daher höhere Konzentrationen an Linker-DNA für die anschließende Hybridisierung der Biotin-DNA erfordert das bereits halbfertige Konjugat aus DNA-BNP und Linker-DNA.

ZUSAMMENFASSUNG

Es wurden zahlreiche Streifentests durchgeführt und es konnte nachgewiesen werden, dass die zuvor geplanten Tests in der Praxis funktionieren und zumindest die DNA des synthetischen Musters nachgewiesen werden kann.

LITERATUR

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Liu, X. O., et al., Extinction coefficient of gold nanoparticles with different sizes and different capping ligands.