112 Figura 26: Espectros infravermelhos de óleos essenciais de Piper Amplum obtidos em diferentes estações do ano. 115 Figura 27: Espectros infravermelhos de óleos essenciais de Piper cernuum obtidos em diferentes estações do ano.
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
Atividade Antimicrobiana
- Staphylococcus aureus
- Streptococcus pyogenes
- Bacillus subtilis
- Escherichia coli
- Dermatofitoses
- Micoses Oportunistas
- Candidíase
- Criptococose
- Aspergilose
- Mucormicose
Entretanto, sob condições apropriadas, podem causar infecções oportunistas, variando desde infecções cutâneas relativamente benignas até doenças sistêmicas potencialmente fatais (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; MURRAY; ROSENTHAL; . PFALLER, 2009; JORGE, 2010; INGRAHAM; WINNRHAM; INGRAHAM, ; et al., 2012). A proteína A, imunógeno, interfere na opsonização e ingestão de microrganismos pelas células polimorfonucleares, ativa o complemento, causa reações de hipersensibilidade (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; . MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; JORGE IN, 20120; INGRAHAM, 2010; et al ..., 2012).
Avaliação da Toxicidade
Mutagenicidade Sobre Saccharomyces cerevisiae
Na fase exponencial, a divisão celular ocorre a cada hora e meia, utilizando a energia obtida na fermentação da glicose. Na fase Diauxica, a disponibilidade de glicose no ambiente diminui, causando a desrepressão catabólica, que paralisa momentaneamente a divisão celular para que as células possam se preparar para o metabolismo respiratório.
Plantas Medicinais
Metabolismo Secundário Vegetal e Influência Sazonal
Em outras palavras, os metabólitos secundários representam uma interface química entre as plantas e o ambiente circundante, onde sua síntese geralmente é influenciada pelas condições ambientais (GOUVEA et al., 2012). Desta forma, a sazonalidade é identificada como um dos fatores mais importantes, uma vez que a quantidade e, por vezes, até mesmo a natureza das substâncias ativas não é constante ao longo do ano (GLOBBO-NETO; LOPES, 2007; SIMÕES et al., 2010; CUNHA, 2011).
Substâncias Obtidas de Plantas Medicinais e Atividade
Óleos Essenciais
Métodos Extrativos de Óleos Essenciais
O arraste de vapor é o método mais utilizado para extrair óleos voláteis, pois eles têm uma pressão de vapor mais alta que a da água e, portanto, são transportados pelo vapor d'água. Ao contrário da destilação a vapor, a hidrodestilação expõe o material vegetal ao contacto direto com a água e a extração ocorre a uma temperatura inferior a 100°C, o que protege os compostos termolábeis.
Métodos de Caracterização de Óleos Essenciais
Para maior confiabilidade na identificação dos compostos, existe o índice de retenção (IR) que relaciona o tempo de retenção dos componentes em análise ao tempo de retenção de um padrão (série homóloga de hidrocarbonetos) (SOUZA-MOREIRA; . SALGADO; PIETRO, 2010). Esta técnica pode detectar compostos moleculares, iônicos, ionizáveis, orgânicos ou inorgânicos, em concentrações ppm e ppb ou inferiores (CIOLA, 2003; SOUZA-MOREIRA; SALGADO; PIETRO, 2010).
Família Piperaceae e o Gênero Piper
Piper amplum
Tal como a grande maioria das espécies deste género, são plantas arbustivas com folhas grandes, com pecíolo de 3-3,5 cm de comprimento, com bainha caniculada e ramos cilíndricos, estriados, glabros, glabros, com cerca de 4-9 entrenós. cm, conforme Figura 8 (GUIMARÃES; VALENTE, 2001).
Piper cernuum
Na literatura científica existe um único trabalho científico sobre avaliação fitoquímica de folhas P. Foram encontrados alguns trabalhos relatando a extração e análise de óleos essenciais de folhas de P. 2001) e Zaindan (2005), avaliaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de P. cernuum pelo método de difusão em ágar, relatando atividade antibacteriana contra S. 2001) também relata atividade antifúngica contra Candida albicans. 2005), analisou o óleo essencial das folhas de P. Quanto à atividade antimicrobiana, Aguiar (2003) avaliou o óleo essencial de P. cernuum pelo método de difusão em ágar, e observou a inatividade da amostra frente a S. 2010), avaliou a atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico bruto das partes aéreas de P. .
Material Vegetal
Obtenção dos Óleos Essenciais e Frações
Partição Líquido-Líquido
Foi adicionado sulfato de sódio anidro suficiente aos óleos obtidos em cada estação para remover a água residual. Alíquotas dos extratos foram combinadas e foi adicionado sulfato de sódio anidro suficiente para remover a água residual. As frações diclorometano e acetato de etila foram filtradas e concentradas em rotaevaporador, na temperatura máxima de 50 °C, para obtenção do resíduo seco (Figura 11).
Caracterização dos Óleos Essenciais
A análise dos óleos essenciais também foi realizada por meio de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN de 1H) e carbono-13 (RMN de 13C), bem como análises de infravermelho (IR). Para análise de RMN, os óleos essenciais das duas espécies de Piper foram diluídos em clorofórmio deuterado na concentração de 0,04 g/ml tendo tetrametilsilano como referência e analisados em aparelho Bruker Avance DPX 300. espécie de Piper, foi realizada pela técnica DRIFTS (Espectroscopia por Transformada de Fourier no Infravermelho de Refletância Difusa), em células de seleneto de zinco, utilizando o Espectrômetro Interfotométrico por Transformada de Fourier IRPrestige – 21, SHIMADZU (Tóquio, Japão).
Material Microbiológico
- Micro-organismos
- Atividade Antimicrobiana
- Preparo de Inóculos Bacterianos
- Preparo de Inóculos Fúngicos
- Bioautografia
- Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
- Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM) e
Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração microbicida mínima (CCM) dos óleos essenciais e frações, diclorometano e acetato de etila, de espécies de Piper de diferentes épocas do ano através do método de diluição em ágar, que consistiu em diluições seriadas dos óleos e frações , em meio de cultura apropriado, para bactérias ou fungos, seguida de incubação e posterior verificação da menor concentração que inibiu o crescimento de micróbios (KALEMBA; . KUNICKA, 2003; OSTROSKY et al., 2008). Para realizar a bioautografia dos óleos essenciais de diferentes estações do ano de duas espécies de Pimenta, eles foram aplicados em placa de TLC sem diluições. Para realizar a bioautografia das frações de diclorometano e acetato de etila provenientes de hidrolatos gerados pela extração de óleos essenciais de diferentes estações do ano de duas espécies de Piper, foi utilizada uma solução com concentração de 4 mg/mL das frações em acetona. e foram aplicadas alíquotas de 10 µL de amostras por spot.
Avaliação de Mutagenicidade
Ativação e Preparação do Ínoculo da Levedura Saccharomyces
Análise Mutagênica
Para realizar o ensaio mutagênico, representado na Figura 17, foi utilizado meio mínimo completo (SC) suplementado com todos os aminoácidos, sendo SC sem histidina (SC-his), SC sem lisina (SC-lys) e SC sem metionina (SC)-met ), dos quais os respectivos aminoácidos foram omitidos, conforme descrito por Ausubel e colegas (1989). Após o período de tratamento, a sobrevivência do microrganismo foi determinada por semeadura em meio mínimo completo (SC). Para tanto, foram realizadas três diluições decimais de cada amostra tratada, semeando uma alíquota de 100 µL da última diluição utilizando alça de Drigalski em placa contendo meio mínimo completo (SC), correspondente a uma concentração de 1 x 103 células/ml.
Análise Estatística
Obtenção dos Óleos Essenciais
Isto sugere que além da sazonalidade e localização geográfica, o processo de secagem do material vegetal pode afetar o rendimento do óleo essencial. 2000) utilizaram folhas frescas coletadas em outubro de 1995 (primavera), com rendimento de óleo essencial de 1,9%. Resultado diferente do observado na mesma época do presente estudo, eles realizaram a extração do óleo essencial de P. O rendimento de óleo da coleta de 1999 foi semelhante ao do presente estudo na primavera (1,663%), porém em 2001 o rendimento foi inferior ao encontrado no presente trabalho para ambas as épocas (1,489 a 2,159%).
Densidade dos Óleos Essenciais
Além disso, as variações nos rendimentos de óleo essencial observadas neste estudo são indicativas de uma complexa rede de fatores e/ou condições ambientais, como temperatura, umidade, duração e intensidade da radiação solar, precipitação, interação com polinizadores e predadores. tanto ao rendimento quanto à síntese de metabólitos secundários (CERQUEIRA et al., 2009). A variação na densidade absoluta observada entre as amostras das duas espécies de Piper, neste estudo, bem como no estudo realizado por Aguiar (2003), pode ter origem na variação na sua composição devido às condições ambientais (SIMÕES et al. al. al. ., 2010). A densidade dos óleos essenciais, entre outras análises físico-químicas, como rotação óptica e índice de refração, são métodos simples e baratos, extremamente importantes para detectar adulterações, muito comuns na comercialização de óleos essenciais, como a adição de óleos inertes ao aumentar o rendimento (SANTOS et al., 2009).
Obtenção das Frações Diclorometano e Acetato de Etila
Os valores de densidade obtidos foram superiores aos observados no estudo realizado por Aguiar (2003), no qual o óleo essencial de P. É importante ressaltar que apenas o estudo realizado por Aguiar (2003) apresenta densidades absolutas de óleos essenciais por época de colheita, mas este não é um estudo sobre o efeito da sazonalidade nos aspectos do óleo essencial. Os rendimentos de frações de acetato de etila, exceto nas estações de verão e outono para P.
Caracterização dos Óleos Essenciais
Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e
No entanto, a percentagem de monoterpenos e sesquiterpenos no presente estudo é semelhante à de Angnes (2005), mas difere quando comparada com Santos et al., 2001), que apresenta uma percentagem semelhante para estas duas classes de terpenos. No estudo realizado com óleos essenciais de folhas frescas de P. a Figura 21 apresenta uma análise comparativa das principais substâncias e suas concentrações em relação a Santos et al. Assim como no presente estudo, Santos et al. 2001) e Angnes (2005) também destacam o α-pineno e o limoneno entre as substâncias mais importantes, Santos et al.
Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrômetro de Massas e
A partir da análise de óleos essenciais em folhas de P. cernuum por GC/MS e índice de retenção, Costantin et al. Em comparação com o presente estudo, Costantin et al. 2001) apresentou maior quantidade e percentual de identificação de voláteis presentes no óleo essencial. Na pesquisa realizada com os óleos essenciais de P. a Figura 25 apresenta uma análise comparativa da maioria das substâncias e suas concentrações em comparação com os estudos realizados por Torquilho et al.
Espectroscopia no Infravermelho – IV
Essas bandas de absorção são geralmente mais intensas, mas nos espectros dos óleos são fracas em intensidade, pois estão em baixa proporção com as demais ligações. Ao avaliar a região entre 1500 e 700 cm-1 nos espectros dos óleos das duas espécies, fica claro que o óleo de P. Assim, ao examinar as diferenças espectrais dos óleos das duas espécies de Piper no presente estudo observar, a análise por espectroscopia IR pode ser útil no controle de qualidade para verificar a autenticidade das espécies em questão, por ser uma metodologia de fácil análise e mais acessível.
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear – RMN
Para cada uma das espécies, os espectros de RMN de 1H foram idênticos para os óleos das quatro coleções representativas das diferentes estações do ano, mas os espectros das duas espécies apresentam diferenças que os distinguem entre si. Desta forma, vários sinais são visualizados nos espectros entre 15 e 55 ppm, nesta região são encontrados carbonos alifáticos, entre 105 e 155 ppm são carbonos olefínicos, entre 70 e 100 ppm são carbonos oxigenados e nesta região a diferença é clara . na composição química dos óleos avaliados. Além das duas substâncias majoritárias, também foi possível identificar os sinais relacionados às demais substâncias majoritárias conforme apresentado na Tabela 7 (FERREIRA et al., 2001; MAATOOQ, 2002).
Bioautografia
Ambas as espécies possuem diversos sesquiterpenos em sua composição, portanto não se pode afirmar quais substâncias podem ter contribuído para a formação do halo de inibição. Ao desenvolver as placas CCD para as frações diclorometano e acetato de etila, referentes às estações inverno, primavera e outono, não foi possível observar qualquer halo de inibição do crescimento microbiano, sugerindo que o sistema solvente utilizado para eluir os CCDs, o hexano: acetato de etila (60:40), não foram adequados para triagem de compostos com atividade antimicrobiana, pois no teste de diluição em ágar foi possível observar pouca atividade antimicrobiana contra S. A Figura 33b mostra a placa eluída com uma fase móvel constituída por hexano:etil acetato (60:40), revelado com anisaldeído sulfúrico e aquecimento.
Avaliação da Atividade Antimicrobiana
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essencias de Piper
Os resultados da atividade antimicrobiana determinados pelo método de diluição em ágar foram comparados com os resultados da bioautografia para os óleos essenciais de P. As Figuras e 41 mostram os resultados da atividade antifúngica dos óleos essenciais das duas espécies de tubérculos deste estudo. Os óleos essenciais dos dois tipos de tuberosa comportaram-se de forma diferente frente a cada microrganismo e nas diferentes estações do ano.
Atividade Antimicrobiana das Frações Diclorometano e Acetato
Devido à atividade antimicrobiana apresentada, este produto também pode ser considerado como alvo de pesquisas sobre substâncias bioativas termorresistentes. Este estudo também observou a inatividade das frações diclorometano e acetato de etila de duas espécies de Piper frente ao C. Como não foi realizada avaliação da composição química das frações diclorometano e acetato de etila das duas espécies de Piper, foi realizada uma análise experimental para o uso de hidrossol na pesquisa de substâncias bioativas.
Avaliação de Mutagenicidade Frente ao Saccharomyces cerevisiae
Composition and antimicrobial activity of the essential oil of two Origanum species, Journal of Agricultural and Food Chemistry. Composition and antifungal effect of essential oils for Piper aduncum, Piper arboretum and Piper tuberculatum. Comparative study of antibacterial and antifungal activity of callus culture and mature plant extracts of Alternanthera maritima (Amaranthaceae).
