UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA GERAL E APICADA
RELATÓRIO CIENTÍFICO 1 BOLSA PNPD - CAPES
Otimização da terapia tolerogênica na encefalomielite experimental: associação de MOG, vitamina D e antioxidante
Pós-Doutoranda: Sofia Fernanda Gonçalves Zorzella Pezavento Supervisora: Profa. Dra. Alexandrina Sartori
Período: 04/2016 a 03/2018
BOTUCATU 2018
1 Sumário
Resumo do Projeto Original Resumo do Relatório Científico
1. Objetivo Geral do Projeto ... 4
2. Objetivos Específicos do Relatório ... 4
3. Delineamento experimental I ... 5
3.1. Introdução ... 5
3.2. Metodologia ... 6
3.3. Resultados e Discussão ... 7
4. Delineamento experimental II ... 11
4.1. Introdução ... 11
4.2. Metodologia ... 12
4.3. Resultados e Discussão ... 13
5. Produção científica durante o período de vigência da bolsa ... 21
6. Referências Bibliográficas ... 24
2 RESUMO DO PROJETO ORIGINAL
A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica e desmielinizante do Sistema Nervoso Central (SNC), que não conta com tratamento eficaz para todos os pacientes. Como não há cura, a caracterização de novas estratégias terapêuticas na EM torna- se imprescindível para a redução dos danos neurológicos e melhora na qualidade de vida. As terapias atuais empregam drogas imunomoduladoras que causam uma inibição global do sistema imune, acarretando um aumento da susceptibilidade aos agentes infecciosos.
Neste contexto, resultados anteriores do nosso grupo demonstraram que estratégias profiláticas e terapêuticas antígeno-específicas baseadas no uso da forma ativa da vitamina D3 (VitD) como adjuvante tolerogênico em associação com MOG (peptídeo da glicoproteína da mielina do oligodendrócito) por via intraperitoneal se mostraram eficazes no controle da encefalite autoimune experimental (EAE), que é um modelo de estudo para a EM. Entretanto, a via intraperitoneal utilizada não pode ser extrapolada diretamente para uso humano. Neste contexto, propomos avaliar a eficácia da administração de MOG e VitD por via oral no desenvolvimento clínico da EAE. Também propomos avaliar se a co-administração de um antioxidante orgânico poderia potencializar essa estratégia terapêutica, visto que o estresse oxidativo e a formação de inflamassomas estão diretamente relacionados com a exacerbação do processo inflamatório. O agente antioxidante de escolha será o produto comercial Selemax® da empresa Biorigin que demonstrou eficácia no controle da artrite experimental. Para executar esta proposta, camundongos C57BL/6 fêmeas serão submetidos à indução de EAE e tratados com MOG+VitD ou MOG+VitD+Selênio por gavagem. Para elucidar os mecanismos de proteção, propomos caracterizar a resposta imunológica na periferia e no SNC, através da análise de subpopulações de linfócitos T (Th1, Th2, Th17 e T reguladora), células dendríticas e micróglia. Análises histopatológicas, marcadores de neuroproteção e contribuição do estresse oxidativo e do inflamassoma permitirão compreender melhor essa estratégia terapêutica antígeno-específica, o que se faz necessário para uma futura aplicação em pacientes com EM. Palavras-chave:
encefalomielite experimental, tolerância oral, vitamina D, selênio orgânico, estresse oxidativo, inflamassoma.
3 RESUMO DESTE RELATÓRIO CIENTÍFICO
Na primeira etapa desse projeto avaliamos separadamente o efeito da vitamina D (VitD) e do Selemax no desenvolvimento clínico da EAE. Os resultados desse relatório foram subdivididos em dois protocolos experimentais. O objetivo do primeiro protocolo foi esclarecer se o efeito terapêutico da VitD na EAE envolve a modulação da atividade do inflamassoma e do estresse oxidativo. Comprovamos a eficácia terapêutica da VitD através da redução da sintomatologia clínica da EAE. Esses resultados foram semelhantes a trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa que mostraram que esse esquema de imunização intraperitoneal é capaz de prevenir o desenvolvimento da EAE em camundongos C57BL/6. Diferentemente do esperado, detectamos um aumento significativo de citocinas pró-inflamatórias nos linfonodos regionais e um aumento discreto de IL-10 e IL-5. Com relação ao estresse oxidativo no SNC, o tratamento com VitD aumentou significativamente os níveis das enzimas antioxidantes e reduziu a taxa de peroxidação lipídica. As análises dos genes envolvidos com a ativação do inflamassoma ainda estão sendo realizadas por PCR em tempo real na porção lombar da medula espinal. Esses resultados preliminares corroboram que a eficácia terapêutica da VitD na EAE envolve a redução do estresse oxidativo no SNC. O segundo delineamento experimental visou comprovar a eficácia tolerogênica da suplementação oral com selênio na EAE. A terapia oral com Selemax® (Biorigin), composto sintetizado a partir de uma cepa inativa de Sacharomyces cerevisiae enriquecida com selênio orgânico, reduziu a incidência da EAE. Esse efeito protetor está associado a uma maior presença de células T reguladoras provavelmente produtoras de IL-10 nos linfonodos regionais. O tratamento apenas com S. cerevisae também foi capaz de reduzir a sintomatologia clínica da doença.
No entanto, verificamos alta incidência da doença e níveis séricos elevados de citocinas pró-inflamatórias. Para elucidar os mecanismos protetores propomos analisar o perfil de linfócitos T e maturação de células dendríticas nos linfonodos mesentéricos, além do estresse oxidativo e da ativação do inflamassoma no SNC. Os resultados promissores obtidos nessa primeira etapa do projeto nos incentivam a esclarecer a eficácia terapêutica por via oral das associações VitD+MOG ou VitD+MOG+selênio na EAE e os mecanismos imunológicos envolvidos.
4 1. OBJETIVO GERAL DO PROJETO
O objetivo geral do presente projeto é avaliar a eficácia e o mecanismo molecular e celular da terapia tolerogênica com MOG+VitD por via oral na encefalomielite experimental e se a adição de um antioxidante orgânico pode potencializar essa estratégia terapêutica.
2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS DO RELATÓRIO
2.1. Esclarecer se o efeito terapêutico da VitD na EAE envolve a modulação da atividade do inflamassoma e do estresse oxidativo.
2.2. Comprovar a eficácia tolerogênica terapêutica do uso do selênio por via oral no desenvolvimento clínico da EAE.
5 3. Delineamento Experimental I: Controle da ativação do inflamassoma e do estresse oxidativo pela vitamina D na encefalomielite autoimune experimental (EAE)
3.1. Introdução
Em 1991, Lemire & Archer demonstraram pela primeira vez que a administração de VitD reduzia a sintomatologia clínica da EAE e aumentava a sobrevida de camundongos SJL. Desde então, vários pesquisadores vêm investigando os mecanismos protetores da terapia com VitD nessa doença. Esses efeitos foram inicialmente associados à redução do número de linfócitos TCD4+, macrófagos e micróglia ativada no SNC (Nafat et al., 1996).
A eficácia do tratamento com VitD na EAE vêm sendo atribuída aos efeitos nas células da resposta imune inata e adaptativa. Foram descritos um menor acúmulo de macrófagos (Nashold et al., 2000), inibição da síntese de quimiocinas e de óxido nítrico sintase (iNOS) além da supressão do recrutamento de monócitos para o SNC (Pedersen et al., 2007). A administração de VitD induz um perfil tolerogênico de DCs (Farias et al., 2013), o que pode acarretar uma redução da diferenciação e migração de células Th17 para o SNC (Chang et al., 2010; Joshi et al., 2011) e um aumento da atividade de Tregs em camundongos com EAE (Joshi et al., 2011; Spanier et al., 2015). Apesar de todos esses estudos, ainda não há um consenso sobre a suplementação de VitD em pacientes com EM. Nesse sentido, a nossa proposta é aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos terapêuticos da VitD nessa doença através da avaliação do estresse oxidativo e do inflamassoma. Estudos recentes propõem que o processo inflamatório e desmielinizante que ocorre na EM é desencadeado pela ativação da micróglia, estresse oxidativo e acúmulo de danos mitocondriais nos axônios (Correale, 2014; Mahad et al., 2015). O estresse oxidativo está diretamente relacionado com a formação de um sistema denominado inflamassoma, o qual amplifica os danos determinados pelas EROs. Alguns estudos já correlacionaram o papel do inflamassoma NLRP3 na EAE e a presença de IL- 1β e IL-18, principais citocinas sintetizadas pelo inflamassoma, em pacientes com EM (Inoue & Shinohara, 2013).
6 3.2. Metodologia
Nesta primeira etapa do projeto, avaliamos se a vitamina D altera o estresse oxidativo e a ativação do inflamassoma no sistema nervoso central (SNC) dos camundongos com EAE. Para tal, camundongos C57BL/6 fêmeas com 8 semanas de idade foram submetidos à indução da EAE com 150µg de MOG (myelin oligodendrocyte glycoprotein – Genemed) emulsificada em Adjuvante Completo de Freund (ACF- Sigma Aldrich) contendo 4mg/ml de Mycobacterium tuberculosis por via subcutânea na região dorsal.
No dia da imunização e 48 horas depois, os animais foram inoculados com 250 ng de toxina pertussis (Sigma Aldrich) via intraperitoneal. O peso e sinais clínicos da doença foram avaliados diariamente. A gravidade da doença foi definida segundo a seguinte escala: 0- normal; 1- cauda frouxa; 2- paraparesia moderada, perda da tonicidade do movimento; 3- paralisia parcial dos membros posteriores; 4- paraplegia; 5- tetraplegia ou morte. Um dia após a indução da doença, iniciamos o tratamento com 8 doses de 0,1µg de vitamina D3 (Sigma Aldrich) em dias alternados. Os animais foram eutanasiados na fase aguda da doença, ou seja, 19 dias após a indução da EAE, conforme o delineamento experimental descrito abaixo. Algumas metodologias ainda estão sendo analisadas e estão apresentadas em vermelho no delineamento experimental.
Os linfonodos inguinais foram coletados, desagregados em cell strainers e as células ressuspendidas em meio RPMI (Sigma) contendo gentamicina, 10% de soro bovino fetal e 2mM de L-glutamina, 2% de aminoácidos não essenciais e 2% de piruvato de sódio. As células totais foram contadas e ajustadas para a concentração de 5x106 células/mL para cultura celular. As culturas de linfonodos regionais foram reestimuladas in vitro com 20µg/ml de MOG. Após incubação em estufa de CO2 (37°C / 5%) durante 48 horas, os sobrenadantes das culturas foram coletados e armazenados a -20°C para posterior dosagem de citocinas. As quantificações de IFN-, TNF-α, IL-6, IL-17, IL-1β, IL-10 e IL-5 foram realizadas através de ensaio imunoenzimático (ELISA), segundo as instruções dos fabricantes (R&D Systems e BD Biosciences). Cérebro e medula espinhal foram coletados e homogeneizados em tampão fosfato de sódio com auxílio de homogeneizador e o sobrenadante foi utilizado para determinar os parâmetros do estresse oxidativo, tais como, dosagens dos radicais livres NO e H2O2, dos produtos do estresse oxidativo (hidroperóxido de lipídio, proteína carbonil), além das enzimas antioxidantes como a catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e superóxido dismutase através de técnicas bioquímicas. A porção lombar da medula espinhal também foi
7 coletada e armazenada a -80ºC para análise dos genes envolvidos com inflamassoma (NLRP3, ASC, caspase-1, IL-1 IL-18) por meio de reações de PCR em tempo real, utilizando-se o sistema TaqMan, com primers e sondas inventoriadas e testadas pela Life Technologies. Os reagentes necessários para estas análises com PCR em tempo real ainda estão sendo adquiridos.
3.3. Resultados e Discussão
Trabalhos recentes do nosso grupo de pesquisa mostraram que esse esquema de imunização de camundongos C57BL/6 com VitD é capaz de prevenir o desenvolvimento da EAE, tanto na estratégia profilática (Mimura et al., 2016) quanto terapêutica (Chiuso- Minicucci et al., 2015). Neste protocolo mantivemos a eficácia terapêutica comprovada pela redução da sintomatologia clínica da EAE (Figuras 1A e 1B) e pela redução
8 significativa do escore clínico máximo (Figura 1D) e alcançado pelos animais tratados com VitD em relação ao grupo controle com EAE. No entanto, os animais apresentam uma perda de peso corpórea após cada dia de tratamento com VitD por via intraperitoneal (Figura 1 C), efeito colateral que já foi relatado em trabalhos anteriores.
Figura 1. Efeito do tratamento com VitD por via intraperitoneal na evolução clínica da EAE. Escore clínico diário (A), regressão linear do escore clínico (B), peso corpóreo diário (C) e média do escore clínico máximo (D). Resultados representam a média ± DP de 6 animais por grupo. *p<0,05.
Diferentemente do esperado, detectamos um aumento significativo da produção das citocinas pró-inflamatórias IFN- (Figura 2A), TNF- (Figura 2B), IL-6 (Figura 2C) e IL-17 (Figura 2D) por células de linfonodos regionais (inguinais) reestimuladas in vitro com MOG em comparação com o grupo controle com EAE. Não houve modulação da produção de IL-1β (Figura 2E). No caso das citocinas anti-inflamatórias, houve um aumento discreto da produção de IL-10 (Figura 2F) e IL-5 (Figura 2G) após o tratamento com vitD. Esses resultados diferem dos achados da literatura que indicam que o efeito da VitD na resposta imune adaptativa envolve uma redução das citocinas pró-inflamatórias, como IFN- e IL-17 (Chang et al, 2010; Joshi et al., 2011), aumento da expressão de IL-
9 4, IL-10 e TGF-β (Cantorna et al., 1998; Spach et al., 2006) e indução de Tregs Foxp3+
(Spanier et al., 2015). Nossos resultados de produção de citocinas nos linfonodos regionais também diferem do trabalho anterior do nosso grupo que mostrou uma redução nos níveis de IL-6 e IL-17 no baço dos animais tratados com VitD (Chiuso-Minicucci et al., 2015). Com relação à produção de IL-1β, que está envolvida na ativação do inflamassoma, a nossa expectativa é de que a VitD seja capaz de reduzir a sua presença no órgão-alvo da doença.
Figura 2. Efeito da terapia com VitD por via intraperitoneal na resposta imune periférica durante a fase aguda da EAE. Produção de IFN-γ (A), TNF-α (B), IL-6 (C), IL-17 (D), IL-1β (E), IL-10 (F) e IL-5 (G) por cultura de células de linfonodos regionais reestimuladas in vitro com MOG. Resultados representam a mediana e intervalos interquartílicos ou a média ±DP de 6 animais por grupo. *p<0,05.
10 Com relação ao estresse oxidativo no SNC, os resultados preliminares são bastante promissores. O tratamento com VitD aumentou significativamente os níveis das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (Figura 3A), catalase (Figura 3B) e superóxido dismutase (Figura 3C) no SNC, se equiparando aos valores produzidos pelos animais sem EAE. Já os animais com EAE apresentaram peroxidação de lipídeos no SNC demonstrado pela alta detecção de hidroperóxido de lipídeo por g de tecido (Figura 3D). Esses resultados inéditos corroboram que um dos efeitos benéficos da VitD na EAE seja através da redução do estresse oxidativo. O efeito imunomodulador da VitD na atividade pró- inflamatória de monócitos/macrófagos tem sido avaliado principalmente in vitro. De forma geral a adição de VitD nestas células resulta em diminuição da produção de derivados de O2, de NO e das citocinas pró-inflamatórias (Jain e Micinski, 2013; Neve et al., 2014). A suplementação com VitD in vitro, em culturas de monócitos aumentou significativamente os mecanismos antioxidantes, como a atividade enzimática da glutationa redutase e da glutationa cisteína ligase e também a formação de glutationa reduzida, resultando em redução de EROs e citocinas pró-inflamatórias (Jain e Micinski, 2013).
Figura 3. Efeito da terapia com VitD por via intraperitoneal no estresse oxidativo no SNC durante a fase aguda da EAE. Detecção de glutationa peroxidase (A), catalase (B), superóxido dismutase (C) e hidroperóxido de lipideo (D). Resultados representam a a média ±DP de 6 animais por grupo. *p<0,05.
11 4. Delineamento Experimental II: Efeito da suplementação com selênio
orgânico no desenvolvimento da encefalite autoimune experimental
4.1. Introdução
A imunopatogênese da EM é complexa, envolvendo a participação de linfócitos Th1, Th17 e células da resposta imune inata, como micróglia e macrófagos, no desenvolvimento do processo inflamatório e degradação da bainha de mielina do SNC (Lucchinetti et al., 2000; Wojkowska et al., 2014; Frischer et al., 2015). Recentemente, tem sido descrito o papel da micróglia na progressão da doença através da produção de citocinas pró-inflamatórias, EROs e enzimas proteolíticas (Correale, 2014). Neste sentido, propomos avaliar o potencial terapêutico do selênio, um elemento químico essencial com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, na EAE.
O selênio (Se) é um elemento químico essencial com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Os efeitos biológicos do Se dependem da sua incorporação em selênio- proteínas, que estão envolvidas nos processos de ativação, proliferação e diferenciação das células do sistema imune inato e adaptativo. Níveis adequados de Se auxiliam na manutenção da homeostase inibindo uma resposta imune excessiva e evitando inflamação crônica através da redução da formação de EROs (Huang et al., 2012). Com relação ao efeito na autoimunidade, estudos comprovaram o efeito terapêutico da suplementação diária com Se em pacientes com tireoidite de Hashimoto (Nacamulli et al., 2010; Toulis et al., 2010). Alguns relatos também sugerem correlação entre níveis séricos de Se e risco aumentado de desenvolver EM e artrite reumatoide, visto que esses pacientes apresentam níveis reduzidos de Se no sangue quando comparados com indivíduos saudáveis (Önal et al., 2010; Socha et al., 2014). Em modelos experimentais de artrite, a terapia oral com Selemax®, uma levedura fonte de selênio orgânico, reduziu os parâmetros clínicos da doença em ratos e camundongos. Este efeito foi associado a uma menor produção de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas no tecido peri-articular (Vieira et al., 2012). A terapia oral com outro composto de Se também reduziu o processo inflamatório no SNC e a incidência da EAE em ratos albinos (Chanaday et al., 2011). Além disso, a selênio- proteína P1 possui papel neuroprotetor, aumentando a sobrevida do neurônio in vitro e prevenindo a morte por apoptose quando essas células são desafiadas in vitro com EROs (Takemoto et al., 2010).
12 4.2. Metodologia
A proposta desta segunda etapa do relatório é avaliar o efeito terapêutico do composto Selemax® (Centro P&D - Biorigin), uma levedura inativa seca que contém níveis elevados de selênio orgânico, produzida a partir de uma cepa de Sacharomyces cerevisiae, no desenvolvimento clínico da EAE em camundongos C57BL/6. Um dia após a indução da EAE, iniciamos o tratamento com doses diárias de 50µg de Selênio por via oral. Os animais foram eutanasiados na fase aguda da doença, ou seja, 19 dias após a indução da EAE, conforme o delineamento experimental descrito abaixo. Algumas metodologias ainda estão sendo analisadas e estão apresentadas em vermelho no delineamento experimental.
Os linfonodos inguinais foram coletados e as culturas foram reestimuladas in vitro com 20µg/ml de MOG. Após incubação em estufa de CO2 (37°C / 5%) durante 48 horas, realizamos a dosagem de citocinas nos sobrenadantes. As quantificações de IL-2, IFN-, TNF-α, IL-6, IL-17, IL-1β e IL-10 foram realizadas através de ensaio imunoenzimático (ELISA), segundo as instruções dos fabricantes (R&D Systems e BD Biosciences).
Analisamos também a presença de citocinas no soro dos animais com o kit Th1Th2Th7 (BD Biosciences) através do método CBA (Cytometric Beads Array).
Para a avaliação de células T reguladoras, células de linfonodos regionais foram coletadas 19 dias após a indução da EAE e incubadas com anti-CD3 de camundongo conjugado com PercPCy5.5 (eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-CD4 conjugado com FITC (eBioscience) e anti-CD25 conjugado com APC (eBioscience). Para análise de Foxp3 intracelular foi utilizado o kit comercial anti-mouse/rat Foxp3 conjugado com PE (eBioscience), segundo instruções do fabricante. Para a análise da maturação das células dendríticas, as células dos linfonodos dos animais foram incubadas com anti- F4/80 conjugado com PercPCy5.5 (eBioscience), anti-CD11c conjugado com FITC (eBioscience), anti-MHCII conjugado com APC (eBioscience), anti-CD86 conjugado com PE (eBioscience) e anti-PDL1 conjugado com PECy7. As amostras foram adquiridas no citômetro de fluxo FACSCanto II (Becton Dickinson, San Jose, CA) do laboratório de Imunologia de Tumores, Instituto de Biociências, UNESP-Botucatu.
13 4.3. Resultados e Discussão
O grupo controle com EAE desenvolveu, como esperado, uma doença típica caracterizada por paralisia e acentuada perda de peso, que se manifestou já a partir do 11º dia após a imunização com MOG+ACF. A suplementação com S. cerevisae ou Selemax por via oral determinou um significativo efeito terapêutico, caracterizado pela redução da sintomatologia clínica diária (Figuras 4A e 4B) e da perda de peso corpóreo (Figura 4C).
No entanto, a presença de selênio determinou uma queda significativa do escore clínico máximo (Figura 4D) alcançado pelos animais e uma menor incidência da doença, que foi de 33% (Figura 4E). A inoculação de selenito de sódio foi tóxica para os animais que não sobreviveram durante todo o experimento. Estamos realizando nesse momento um
14 protocolo com uma selenioproteína sintetizada pela Biorigin. Esses resultados serão apresentados no próximo relatório científico. Esse efeito protetor do Selemax foi similar a estudos anteriores empregando um modelo experimental de artrite em camundongos (Vieira et al., 2012).
A produção das citocinas pró-inflamatórias IFN- (Figura 5B), TNF- (Figura 5C), IL-6 (Figura 5D), IL-17 (Figura 5E) e IL-1β (Figura 5F) por células de linfonodos regionais (inguinais e axilares) reestimuladas in vitro com MOG foi bastante similar nos diferentes grupos experimentais com EAE (controle e tratados). No caso das citocinas anti-inflamatórias, o grupo tratado com Selemax produziu níveis significativamente mais elevados de IL-10 (Figura 5G) em relação aos demais grupos com EAE. As amostras estão armazenadas para posterior dosagem de TGF-. Analisamos também a presença de citocinas no soro dos animais. O grupo tratado com S. cerevisae apresentou níveis elevados das citocinas pró-inflamatórias IFN- (Figura 6A), TNF- (Figura 6B) e IL-17 (Figura 6D) em relação ao grupo controle com EAE. Já o grupo suplementado com selênio produziu quantidades similares das citocinas de perfil inflamatório ou regulador (Figuas 6A-D) quando comparado ao grupo EAE sem tratamento. Acreditamos que por conta da via oral, a avaliação do perfil de linfócitos T nos linfonodos mesentéricos seja imprescindível para a melhor compreensão dos mecanismos protetores. As amostras já foram coletadas e as análises serão realizadas por PCR em tempo real.
15 Figura 4. Efeito da suplementação com Selemax por via oral na evolução clínica da EAE.
Escore clínico diário (A), regressão linear do escore clínico (B), variação de peso corpóreo (C), média do escore clínico máximo (D) e incidência da doença (F). Resultados representam a mediana e intervalos interquartílicos ou a média ±DP de 5-6 animais por grupo. *p<0,05.
16 Figura 5. Efeito da suplementação com Selemax por via oral na resposta imune periférica durante a fase aguda da EAE. Produção de IL-2 (A), IFN-γ (B), TNF-α (C), IL-6 (D), IL- 17 (E), IL-1β (F) e IL-10 (G) por cultura de células de linfonodos regionais reestimuladas in vitro com MOG. Resultados representam a mediana e intervalos interquartílicos ou a média ±DP de 5-6 animais por grupo. *p<0,05.
17 Figura 6. Efeito da suplementação com Selemax por via oral na resposta imune periférica durante a fase aguda da EAE. Produção de IFN-γ (A), TNF-α (B), IL-6 (C), IL-17 (D), IL-4 (E) e IL-10 (D) no soro dos animais. Resultados representam a mediana e intervalos interquartílicos ou a média ±DP de 5-6 animais por grupo. *p<0,05.
18 Atualmente, ênfase especial tem sido dada à participação de células T reguladoras (Tregs) na EAE, visto que deficiências numéricas e funcionais destas células têm sido descritas em pacientes com EM (Kouchaki et al., 2014). Portanto, as mesmas constituem alvos importantes nas terapias emergentes para esta doença (Buc, 2013). Nesse sentido, um dos mecanismos protetores do Selemax no nosso trabalho envolve a participação de Tregs. O tratamento com Selemax reduziu o percentual de linfócitos T CD3+ (Figura 7A) e CD4+ (Figura 7B) nos linfonodos regionais. No entanto, detectamos um aumento significativo do número de Tregs Foxp3+ (Figura 7C) nos animais que receberam S.
cerevisae e Selemax. Esse aumento de Tregs produtoras de IL-10 pode ser um dos mecanismos de eficácia terapêutica do selênio, visto que as Tregs controlam o processo inflamatório na EAE (Stephens et al., 2009).
A indução de células T com atividade supressora (Tregs) está relacionada à interação com células dendríticas (DCs) tolerogênicas (Kornete & Piccirillo, 2012), as quais apresentam expressão reduzida de moléculas co-estimulatórias, se tornando incapazes de estimular a proliferação de linfócitos T efetores. Apesar do aumento significativo do porcentual de Tregs nos animais tratados, essa suplementação não alterou a maturação das células dendríticas quando comparado ao grupo controle com EAE (Figuras 7A-C)
19 Figura 7. Efeito da suplementação com Selemax por via oral na quantidade de células T reguladoras durante a fase aguda da EAE. Percentual de linfócitos T CD3+ (A), T CD3+CD4+ (B) e CD25hiFoxp3+ (C) nos linfonodos regionais calculados em relação ao total de linfócitos T CD3+CD4+ em 100.000 eventos adquiridos. Resultados representam a mediana e intervalos interquartílicos ou a média ±DP de 5-6 animais por grupo.
*p<0,05.
20 Figura 8. Efeito da suplementação com Selemax por via oral na quantidade de células T reguladoras e ativação de células dendríticas durante a fase aguda da EAE. Intensidade de fluorescência das moléculas MHCII (A), CD86 (B) e PDL-1 (C) em células dendríticas F4/80-CD11c+ nos linfonodos regionais calculados em 500.000 eventos adquiridos.
Resultados representam a mediana e intervalos interquartílicos ou a média ±DP de 5-6 animais por grupo. *p<0,05.
21 5. Produção científica durante o período de vigência da bolsa
5.1.Witaicenis, A.; Oliveira, E.C.S.O; Tanimoto A.; Zorzella-Pezavento, S.F.G;
Oliveira, S.L.O.; Sartori, A.; Di Stasi, L.C. 4-methylesculetin, a coumarin derivative, ameliorates dextran sulfate sodium-induced intestinal inflammation.
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5.2.Zorzella-Pezavento, S.F.G.; Ishikawa, L.L.W.; Fraga-Silva, T.F.C.; Mimura, L.A.N.; Sartori, A. Therapeutic and prophylactic potential of vitamin D for multiple sclerosis. In: "A Crtitical Evaluation of Vitamin D-Clinical Overview"
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18, n. 7, p. 998-1008, 2016.
5.7. Fraga-Silva, T.F.C.; Mimura, L.A.N.; Zorzella-Pezavento, S.F.G.; Ishikawa, L.L.W.; Franca, T.G.D.; Thome, R..; Verinaud, L.; Arruda, M.S.P.; Sartori, A.
Tolerogenic vaccination with MOG/VitD overcomes aggravating effect of C.
22 albicans in experimental encephalomyelitis. CNS Neuroscience & Therapeutics, 2016. DOI: 10.1111/cns.12572.
5.8.Ishikawa, L.L.W.; Colavite, P.M.; Fraga-Silva, T.F.C.; Mimura, L.A.N.; Franca, T.G.D.; Zorzella-Pezavento, S.F.G.; Chiuso-Minicucci, F.; Marcolino, L.;
Marques, C.; Ikoma, M.R.V.; Sartori, A. Systemic administration of proteoglycan protects BALB/c retired breeder mice from experimental arthritis. Journal of Immunology Research, 2016:6765134, 2016.
5.9. Mimura, L.A.N.; Chiuso-Minicucci, F.; Fraga-Silva, T.F.C.; Zorzella- Pezavento, S.F.G.; França, T.G.D.; Ishikawa, L.L.W.; Penitenti, M.; Ikoma, M.R.V.; Sartori, A. Association of myelin peptide with vitamin D prevents autoimmune encephalomyelitis development. Neuroscience, v. 317, p. 130-140, 2016.
5.10. Estágio científico no exterior: Estágio realizado durante o período de 03 a 21 de abril de 2017 no grupo de pesquisa do Prof. Tomas Olsson no departamento de Neurociências Clínicas, Instituto Karolinska, Estocolmo-Suécia.
O estágio foi supervisionado pelos pesquisadores André Ortlieb Guerreiro Cacais e Milena Zeitelhofer-Adzemovic.
5.11. Evento científico no exterior: Apresentação oral do trabalho “Therapy with epicutaneous application of MOG plus vitamin D analogue is highly effective in experimental encephalomyelitis” no 10th International Congress on Autoimmunity, Leipzig - Alemanha, em abril de 2016.
5.12. Disciplina ministrada: Imunologia Básica, ministrado no Curso de Especialização em Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu, no período de 23 de maio a 20 de junho 2016, carga horária de 15 horas.
5.13. Curso de curta duração ministrado: Minicurso sobre “Influência de fatores ambientais no desenvolvimento de doenças autoimunes”, ministrado durante a XXIII Semana da Biologia em Bauru, no dia 18 de maio de 2016, carga horária de 4 horas.
5.14. Curso de curta duração ministrado: Minicurso sobre “Tolerância oral e autoimunidade: o sistema imunológico no combate ao nosso próprio organismo, abordagem teórico-prática”, ministrado durante o V Congresso de Biociências em Botucatu, nos dias 12 e 13 de maio de 2016, carga horária de 8 horas.
5.15. Aulas em disciplina de Pós-graduação: Palestra sobre “Efeito imunomodulador da vitamina D na esclerose múltipla” ministrada para alunos do
23 Curso da Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada do IBB da UNESP de Botucatu, abril de 2016.
5.16. Co-orientação de dissertação: “Comparação do efeito imunomodulador da vitamina D e do paricalcitol em camundongos C57BL/6 e DBA/1J”, desenvolvida pela aluna Aline Parisoto Missio do curso de Pós-graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu, no período de novembro de 2014 a agosto de 2016.
5.17. Co-orientação de monografia: “Efeito terapêutico da associação MOG epicutânea e rapamicina na encefalite autoimune experimental”, desenvolvida pela aluna Carolina Angelo de Oliveira do curso de Ciências Biomédicas, no período de julho de 2015 a julho de 2016, com bolsa FAPESP – Processo nº 2015/15707-8.
5.18. Defesa de Tese: membro titular da Comissão Examinadora da Defesa de Tese do pós-graduando Leonardo Teixeira Lopes de Medeiros, no programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu, no dia 13 de setembro de 2016.
5.19. Qualificação de Doutorado: membro titular da Comissão Examinadora do Exame Geral de Qualificação, nível doutorado, da pós-graduanda Mariana Romão Veiga, no programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada do Instituto de Biociências da UNESP de Botucatu, no dia 11 de outubro de 2016.
5.20. Qualificação de Mestrado: membro titular da Comissão Examinadora do Exame Geral de Qualificação, nível mestrado, da pós-graduanda Vanessa Rocha Ribeiro, no programa de Pós-Graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia da Faculdade de Medicina da UNESP de Botucatu, no dia 11 de novembro de 2016.
24 6. Referências Bibliográficas
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26 Apreciação do supervisor sobre o desempenho da pós-doutotanda
O relatório apresentado pela pós-doutoranda Sofia Zorzella-Pezavento é constituído por duas abordagens envolvendo o emprego de fármacos no controle do desenvolvimento clínico da encefalite autoimune experimental (EAE). Foi avaliado separadamente o efeito da vitamina D (VitD) e do Selemax no desenvolvimento clínico da EAE. O objetivo do primeiro protocolo foi esclarecer se o efeito terapêutico da VitD na EAE envolve a modulação da atividade do inflamassoma e do estresse oxidativo. Os resultados preliminares corroboram que a eficácia terapêutica da VitD na EAE envolve a redução do estresse oxidativo no SNC. Já no segundo delineamento experimental observamos uma eficácia terapêutica da suplementação oral com selênio na doença. Os resultados são promissores e nos incentivam a esclarecer os mecanismos imunológicos envolvidos. Vale a pena ressaltar que o relatório está muito bem escrito, organizado e ilustrado de forma adequada, portanto considero o mesmo totalmente satisfatório. O desempenho acadêmico da aluna de pós-doutoramento durante esse período foi satisfatório e altamente produtivo. A sua produção científica está detalhada no item 5 deste relatório.
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Profa. Dra. Alexandrina Sartori
