PADRÃO DE CITOCINAS SINTETIZADAS POR LEUCÓCITOS CIRCULANTES APÓS ESTIMULAÇÃO IN VITRO COM ANTÍGENO SOLÚVEL DE LEISHMANIA. Duração da imunidade vacinal na leishmaniose visceral: padrão de citocinas sintetizadas pelos leucócitos circulantes após estimulação in vitro com antígeno solúvel de Leishmania chagasi XIII Figura 9- Perfil de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos T CD8+ do sangue periférico de cães vacinados com Leishmune® após estimulação in vitro com antígeno solúvel de Leishmania chagasi..71.
O objetivo do nosso estudo foi avaliar o perfil de citocinas em cães em diferentes momentos após a vacinação com Leishmune ® após estimulação in vitro com antígeno solúvel de Leishmania chagasi.
Objetivos específicos
Animais
Todos os cães participantes dos grupos T1, T6 e T12 eram primos vacinados com Leishmune®, conforme protocolo de imunização recomendado pelo fabricante (três doses com intervalo de 21 dias entre elas). O estudo foi realizado de forma transversal, de modo que cada cão participou de apenas uma coleta e, portanto, de apenas um grupo. Todos os procedimentos descritos neste trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da CEUA - FIOCRUZ (PROTOCOLO nº P-71/11-3).
Amostras
Foto 1 – (A) Tubo com hemocultura após 48 horas de cultivo sob estímulo, antes da centrifugação - (B) Tubo com hemocultura após 48 horas de cultivo sob estímulo, após centrifugação. Para avaliar a resposta imune celular, dois desenhos experimentais foram estabelecidos, um através do ensaio de imunofenotipagem celular e marcação de citocinas intracitoplasmáticas avaliadas por citometria de fluxo e outro através da análise de citocinas solúveis secretadas no sobrenadante da cultura, utilizando ensaio imunoabsorvente ligado a enzima ( ELISA). Na segunda, foram realizados ELISAs para determinar os níveis de citocinas (IL-8, TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10) secretadas por leucócitos periféricos após cultivo in vitro, sob estimulação com antígeno solúvel de Leishmania chagasi . , por 48 horas.
6 - Obtenção do Antígeno Solúvel de Leishmania chagasi (ASL) utilizado como estímulo para leucócitos em hemoculturas totais por 48 horas. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e a massa do parasita ressuspensa em PBS (0,15 M, pH 7,2) e centrifugada nas mesmas condições anteriores. Para a obtenção deste antigénio, a massa de Leishmania obtida conforme descrito no ponto anterior (6.1) foi submetida a dez ciclos de congelação em azoto líquido e descongelação em banho-maria a 37ºC.
Após esta etapa, a massa parasitária foi submetida a três ciclos de desintegração mecânica utilizando um homogeneizador elétrico de pistão de Teflon (Virtis) por 1 minuto a 5000 rpm com intervalos de 30 segundos. O sobrenadante contendo o antígeno solúvel de Leishmania foi coletado e transferido para uma membrana de diálise e então dialisado contra PBS (0,15 M, pH 7,2) a 4 °C com agitação constante por 24 h. Alíquotas de antígeno com concentração de proteína de 1000 µg/mL foram preparadas e mantidas congeladas a -70 °C até o uso.
Ensaio da imunofenotipagem celular e marcação de citocinas
O restante do sangue foi transferido para este último tubo, homogeneizado e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente e protegido da luz. Os tubos foram incubados por 10 min em temperatura ambiente ao abrigo da luz e então centrifugados a 400 x g por 7 min. 500 µL de PBS-W e 3,0 mL de PBS-P (PBS contendo 0,5% BSA, 0,5% saponina e 0,1% azida sódica) foram adicionados a cada tubo e homogeneizados lentamente por pelo menos 10 vezes por inversão (tubo fechado no segundo estágio).
Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes, a primeira vez com 130 µL de PBS-P e a segunda com 140 µL de PBS-W por centrifugação das amostras a 400 x g por 7 min em temperatura ambiente. Tabela 2 - Painel de anticorpos monoclonais utilizados em ensaios de imunofenotipagem celular e marcação in vitro de citocinas intracitoplasmáticas. 8 - Estratégia para análise de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo em culturas de sangue total.
Determinação da frequência de linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ que expressam citocinas intracitoplasmáticas (IL-17a, TNF-α, IFN-γ, TGF-β, IL-4). A análise das frequências dos linfócitos T CD4+ e T CD8+ que expressam citocinas intracitoplasmáticas (IL-17a, TNF-α, IFN-γ, TGF-β, IL-4) foi realizada pela estratégia de análise convencional. Esse tipo de análise consistiu em selecionar a população celular de interesse, com base em aspectos morfométricos, por meio de gráficos de distribuição pontuada de FSC versus SSC (Figura 1A).
Análise de citocinas secretadas por leucócitos periféricos por meio de
Em seguida, 25 μL de anticorpo biotinilado devidamente diluído em PBS contendo 0,1% de soroalbumina bovina (BSA) e 0,05% de azida (NaN3) foi adicionado a cada poço da placa. As placas foram novamente mantidas no escuro e incubadas em temperatura ambiente por uma hora e meia, sendo então lavadas com PBS-Tween 20. Em seguida, após a retirada do sobrenadante, 25 μL de avidina peroxidase (R&D Systms, Inc., Minneapolis, EUA, DY998) diluído em PBS contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e 0,05% de azida (NaN3).
Após a incubação, eles foram lavados novamente 4 vezes consecutivas com 100 µL de solução de PBS-Tween 20 e 25 µL de solução de substrato (mistura 1:1 de H2O2 e tetrametilbenzidina) foram adicionados a cada poço. As placas foram novamente incubadas à temperatura ambiente por 30 minutos e protegidas da luz. As placas foram lavadas 4 vezes com 100 µL de solução de lavagem PBS-Tween 20 e incubadas à temperatura ambiente com solução de bloqueio (1% BSA em PBS) por 1 h.
Uma nova etapa de lavagem foi realizada com 100 µL de PBS-Tween 20 e, em seguida, 25 µL da amostra foram adicionados sem diluição a cada poço. Para estabelecer a curva padrão, 25 µL da proteína recombinante de cada citocina, diluída em PBS com 1% BSA, foram adicionados simultaneamente em diluição seriada, iniciando com a concentração inicial de 4000 pg/mL. Em seguida, foram adicionados 25 µL de solução de substrato, correspondendo a uma mistura 1:1 de reagente de cor A, H2O2 e reagente de cor B, tetrametilbenzidina (R&D Systems, DY999).
Análise estatística dos dados
A Figura 8 mostra os resultados do índice de linfócitos T CD4+ citocina+ (ASL/controle) por tempo após a vacinação durante a estimulação in vitro com antígeno solúvel de Leishmania chagasi. A análise dos dados mostrou aumento do índice de linfócitos T CD4+ TNF-a+ no grupo de animais após um mês de vacinação (T1) em relação ao grupo de animais não vacinados (T0). Observou-se que esse aumento não durou no grupo de animais um ano após a vacinação (T12), mostrando um retorno aos níveis basais semelhantes aos observados no grupo de animais antes da vacinação (T0).
A análise dos dados também mostrou um aumento no índice de linfócitos T CD4+ IFN-γ+ em T6 em relação ao grupo de animais não vacinados (T0). Nas análises dos índices T CD4+ IL-17a+, T CD4+ TGF-β+ e T CD4+ IL-4+, não foi observada diferença significativa ao comparar o grupo de animais não vacinados e vacinados. T0) Grupo de animais não vacinados; (T1) Grupo de animais 1 mês após a vacinação, (T6) Grupo de animais 6 meses após a vacinação, (T12) Grupo de animais 12 meses após a vacinação.
Os resultados são expressos como citocina + índice celular versus tempo pós-vacinação. Perfil de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos T CD8+ do sangue periférico de cães vacinados com Leishmune® após estimulação in vitro com.
Metodologias foram utilizadas para avaliar o impacto da imunização de cães submetidos à primovacinação com a vacina Leishmune® no perfil de citocinas intracitoplasmáticas no sangue periférico e citocinas presentes no sobrenadante. Para tanto, realizamos um protocolo de imunofenotipagem de células sanguíneas periféricas de cães após o procedimento de vacinação a fim de avaliar o impacto da imunização com Leishmune® no perfil de síntese intracitoplasmática de citocinas tipo 1 e tipo 2 em linfócitos caninos após a interação de sangue periférico com antígeno solúvel de Leishmania chagasi e o protocolo de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) para avaliar o perfil de síntese de citocinas secretadas por leucócitos em sobrenadante de hemocultura periférica após estimulação com antígeno solúvel de Leishmania chagasi. Também determinamos os níveis de citocinas (IL-8, TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10) secretadas por leucócitos periféricos após estimulação in vitro pela técnica de ELISA.
Em nosso estudo, o perfil de citocinas secretadas pelos leucócitos do sangue periférico de cães imunizados, quando avaliado através da frequência cumulativa (%) de cães após 6 meses, mostrou diminuição de IL-10 em relação aos animais não vacinados, confirmando um perfil protetor , juntamente com um aumento de IL-8 e IFN-γ também observado. A análise do perfil de assinatura de citocinas dos leucócitos dos cães confirma os resultados anteriores, pois mostra que a vacina desencadeia uma resposta com perfil de imunidade inflamatória nos animais, principalmente devido ao aumento da produção de citocinas como a IL-8 e IFN-y no grupo de animais um e seis meses após a vacinação, juntamente com uma diminuição significativa de IL-10 seis meses após a vacinação em relação ao grupo de animais não vacinados. Por outro lado, a análise do perfil de assinatura de citocinas no grupo de cães com dose meses após a vacinação revelou diminuição das citocinas inflamatórias e aumento das regulatórias, demonstrando um perfil mais semelhante ao do grupo de não vacinados . animais.
Nosso estudo teve como objetivo caracterizar a contribuição da imunidade adaptativa no contexto da vacinação anti-LVC, para isso, realizamos um estudo do perfil de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos T periféricos de cães vacinados após estimulação in vitro com antígeno solúvel de Leishmania chagasi. O direcionamento da resposta imune para um padrão de participação efetiva de linfócitos B, linfócitos T CD8+, bem como células da imunidade inata, parece, portanto, ser consequência direta do perfil do microambiente das citocinas. Por outro lado, em um microambiente com predominância de citocinas do tipo 2 (como IL-4 e IL-10) parece haver um favorecimento de eventos de síntese de anticorpos por células B [115].
Considerando que, 1 ano após a vacinação, os animais não apresentam mais evidências de uma resposta imune protetora, como o perfil de citocinas intracitoplasmáticas nas células T (tanto T CD4+ quanto T CD8+), apresentando níveis basais semelhantes aos animais não vacinados, portanto, os animais precisa de uma vacina de reforço. Em suma, os resultados obtidos neste estudo permitiram identificar o perfil de citocinas produzidas por leucócitos circulantes no sangue periférico de animais em diferentes momentos após a imunização com a vacina Leishmune ® por meio da busca de marcadores biológicos que identifiquem um perfil de imunidade protetora resposta em cães vacinados, o que é indicativo da eficácia da vacina.
