Integração de expressão gênica e dados proteômicos em redes de interação proteína-proteína do Trypanosoma cruzi / Frederico Gonçalves Guimarães. Integração de expressão gênica e dados proteômicos em redes de interação proteína-proteína do Trypanosoma cruzi.
O desafio da integração de dados biológicos
Tal conhecimento requer a integração de dados de diversas áreas dentro e fora da Biologia. E aqui novamente enfrentamos a questão da diversidade de dados, desta vez relacionada com bases de dados.
Redes biológicas
Dependendo da natureza de sua interação, uma rede pode ser direcionada se a interação entre seus nós tiver uma direção bem definida. Uma rede de interação proteica geralmente não é direcionada, pois geralmente representa apenas as interações físicas entre proteínas, sem qualquer direção predeterminada.
O Trypanosoma cruzi no contexto das doenças negligenciadas
Em outros países, como EUA, Austrália, Japão e algumas partes da Europa, as transmissões autóctones são extremamente raras, porém vários casos foram relatados devido à imigração de pessoas infectadas de áreas endêmicas (CONNERS et al., 2016; GASKON; BERNA; PINAZO, 2010; OMS, 2016). Devido a esses mecanismos, a regulação da expressão gênica é pós-transcricional (FERNÁNDEZ-MOYA; ESTÉVEZ, 2010; GAUDENZI et al., 2011).
Justificativa
Objetivo geral
Objetivos específicos
Obtenção dos dados
- Dados de RNASeq e Shotgun Proteomics
- Seleção de genes integrantes de famílias multigênicas
- Seleção de genes diferencialmente expressos
- Consenso dos dados
Para a realização das análises realizadas no âmbito deste trabalho, utilizamos apenas o consenso desses dados, ou seja, genes expressos diferencialmente que codificam proteínas que também foram identificadas como expressas diferencialmente. Uma vez realizado um agrupamento de dados de RNA e proteínas, fomos novamente confrontados com representantes de famílias multigênicas.
Configuração do espaço de trabalho para o desenvolvimento do projeto
Para selecionar RNAs e proteínas regulados positiva e negativamente, no que diz respeito à infectividade, os dados de expressão de RNA e proteína foram submetidos aos critérios de corte logFoldChange (logFC) de 0,99 e um valor p ajustado inferior a 0,05 que encontramos um total de 2.129 genes expressos diferencialmente e 380 proteínas expressas diferencialmente. Este consenso foi alcançado agrupando os dados em quatro categorias, dependendo da regulação (negativa ou positiva) de RNA e proteína: RNA neg/proteína neg, RNA neg/proteína pos, RNA pos/proteína neg e RNA pos/proteína pos.
Construção dos arquivos utilizados como origem dos dados de análise
Por fim, criamos outro arquivo denominado de_proteins_common_results-non-multigene-one_multigene-only_gene_ids.tsv, que contém apenas informações sobre identificadores de genes (gene id).
Pesquisa pelos identificadores do STRING utilizando busca por similaridade
O método utilizado para encontrar esses identificadores foi realizar uma busca de similaridade de sequência contra as proteínas T. Lá, após escolher o organismo de interesse – no caso deste trabalho, Trypanosoma cruzi –, transferimos o arquivo 353153.protein.sequences. v10 .fa.gz para a pasta /proteins/blast/database.
Estruturação da rede no STRING
O arquivo gerado com os resultados (tcruzi_non-multigenic_from_TcruziSylvioX10- vs.353153.protein.sequences.v10-best_hits-only_ids.txt) foi utilizado como entrada de pesquisa no site STRING através da função de pesquisa multiproteína. Vamos criar uma padronização nos nomes dos arquivos e prefixar "tcruzi_proteins-" para cada nome STRING original.
Obtenção e filtragem da rede com todas as interações de proteínas de T. cruzi
Preparação dos dados utilizados na análise de enriquecimento funcional da
- Informação funcional: Categorias de regulação RNA/proteína
- Informação funcional: Natureza da interação entre as proteínas
- Informação funcional: EC numbers
- Informação funcional: Anotação funcional das proteínas
Com isso, foi gerado o arquivo de_proteins_common_results-non-multigene-one_multigene-gene_id-regulation.tsv. Por fim, juntamos as informações dos dois arquivos gerados em um terceiro, de_proteins_common_results-non-multigene-one_multigene-gene_id-regulation.tsv. TcruziSylvioX10-string_ids.tsv de_proteins_common_results-non-multigene-one_multigene-gene_id-regulation.tsv | classificar -k2 >.
A partir deste arquivo foi criado um novo (tcruzi_proteins-string_proteins_annotations-unique_ec_numbers-colors.tsv), associando cada um dos números EC encontrados a um código, que é a representação da cor em notação hexadecimal RGB.
Modelagem das redes no Cytoscape
Entrada e processamento dos dados
Mais uma coluna foi criada na tabela de nós, visível na visualização da rede. Após selecionar cada um dos arquivos, alteramos/confirmamos uma série de parâmetros na janela que se abre, incluindo o nome e atributo das colunas de dados (à semelhança do que foi feito na importação inicial da rede). Para isso, acessamos novamente o menu Arquivo → Importar → Rede → Arquivos e abrimos o arquivo 353153.protein.links.detailed.v10-experiment_database-combined_400.tsv, que está localizado na pasta /proteins/string.
Na janela que se abre, selecione a rede STRING - DB/Experiments - Combined 400 e a opção Ignore edge direction.
Análise da rede
Assim, cada etapa metodológica foi planejada e testada de forma abrangente para que pudesse ser reproduzida nas mais diversas situações e possibilitar sua implementação também para outros organismos modelo. Pensando nisso, os resultados de cada uma das etapas metodológicas são descritos detalhadamente, seção por seção, para permitir inclusive sua implementação separada ou adaptação para atender outros protocolos.
Obtenção e consenso dos dados
Considerando a natureza deste trabalho, que é a construção de uma integração sistemática de dados em RIPPs, o desenvolvimento da metodologia é o nosso principal resultado e não apenas um meio para alcançar o resultado. Representam a origem, as adições/alterações sofridas durante o processamento e o contexto a que se referem. Por exemplo, o arquivo tcruzi_proteins-string_interactions.tsv contém dados de interação de proteínas e foi obtido no site STRING.
Durante as análises, utilizamos alguns scripts para automatizar tarefas de processamento computacional.
Construção dos arquivos utilizados na origem dos dados de análise
Pesquisa pelos identificadores do STRING utilizando busca por similaridade
Para realizar a busca por similaridade de sequências com o BLAST é necessário criar um banco de dados que servirá como alvo da busca. Como é possível transferir arquivos contendo as sequências de aminoácidos de todas as proteínas armazenadas de cada um dos organismos cadastrados no site STRING para um computador local, utilizamos esta fonte para criar o banco de dados BLAST. A partir do arquivo de saída gerado pelo script anterior (tcruzi_proteins_from_TcruziSylvioX10-vs-353153.protein.sequences-info_extraction.tsv), selecionamos os melhores acertos para cada um dos resultados do BLAST, levando em consideração informações de identidade e cobertura.
O arquivo tcruzi_proteins_from_TcruziSylvioX10-vs-353153.protein.sequences.v10-best_hits.tsv mostrando essas correlações pode ser encontrado no Apêndice 3.
Estruturação da rede no STRING
Como este resultado apenas evidenciou a presença de esferas isoladas (nós), iniciamos um estudo visando determinar os parâmetros que permitiriam o estabelecimento de relações entre as proteínas em questão e suas vizinhas. Esta variável especifica os primeiros vizinhos de cada uma das proteínas pesquisadas, e um valor de 500 especifica a interação total do conjunto de todas as proteínas mapeadas na rede, ao invés das individuais. Dado que o STRING não dispõe de ferramentas mais adequadas para este tipo de análise, utilizamos a opção de exportar os dados da página.
Os vizinhos foram obtidos no banco de dados STRING, com base nos critérios de corte: pontuação mínima de interação exigida: 0,400 e fontes de interação ativas: Experimentos e bancos de dados.
Obtenção e filtragem da rede com todas as interações de proteínas de T. cruzi
Os resultados obtidos com esta fórmula corresponderam às nossas expectativas, então esta foi a fórmula utilizada em nosso comando awk.
Preparação dos dados utilizados no enriquecimento funcional da rede
- Informação funcional: Categorias de regulação RNA/proteína
- Informação funcional: Natureza da interação entre as proteínas
- Informação funcional: EC numbers
- Informação funcional: Anotação funcional das proteínas
É importante notar que os números EC não podem ser usados para identificar enzimas específicas, mas sim a reação catalisada pela enzima. Em nosso trabalho, utilizamos a associação dos números CE com proteínas como forma de caracterizar seu papel no metabolismo T. Operacionalmente, essa tarefa foi realizada associando cada um dos números CE encontrados em um código, que é a representação da cor em RGB hexadecimal notação.
Após encontrar os números de CE de três dos seis grupos superiores (EC2, EC3 e EC6), decidimos utilizar uma funcionalidade deste módulo, que é a capacidade de definir tonalidades diferentes para os grupos (EC2: vermelho, EC3: verde, EC6: azul).
Modelagem das redes no Cytoscape
A ferramenta Cytoscape
À direita (FIGURA 15-2) temos a área de visualização da rede selecionada na coleção, denominada neste trabalho como “área de visualização da rede”. Cada um dos nós da rede ali exibidos pode ser movido livremente e o zoom da imagem também pode ser controlado. Por fim, na parte inferior da tela (FIGURA 15-3) encontramos a tabela com todos os dados associados à rede selecionada, denominada neste trabalho como “tabela de dados da rede”.
Feita a análise, é possível associar seus resultados aos estilos e alterar a representação visual da rede.
Entrada e processamento dos dados
Isso ocorre porque o Cytoscape combina automaticamente os dados de entrada com os dados da coluna usada como indexador. Como as colunas de uma tabela importada podem servir como indexadores para tabelas subsequentes, a ordem de entrada das tabelas de dados também é importante. Como exemplo específico, podemos citar a associação estabelecida entre os resultados obtidos nas análises das vias metabólicas via número CE e a atribuição de cores correspondente (arquivos tcruzi_proteins-string_proteins_annotations-ec_numbers.tsv e tcruzi_proteins-string_proteins_annotations-unique_ec_numbers-colors.tsv) onde a coluna ec_number do primeiro conjunto de dados serviu como índice para a coluna ec_number_color do segundo conjunto.
Quando as colunas de consulta e índice correspondem, o Cytoscape também elimina automaticamente quaisquer incompatibilidades.
Análise da rede gerada
Conforme descrito na Seção 1.2, as redes biológicas tendem a ser livres de escala, o que pode ser apreciado ao analisar o gráfico de distribuição dos nós da rede. Como as redes sem escala seguem uma distribuição de lei de potência, da forma y = axb, aplicamos um ajuste a este gráfico e obtemos o resultado mostrado na FIGURA. A correlação encontrada foi de 0,619, o que não é expressivo, mas ainda assim suficiente para comprovar que a distribuição dos nós segue uma lei de potência.
A linha representa o resultado do ajuste desta distribuição com uma lei de potência da forma y = axb.
Exploração dos estilos de formatação da rede
Deve-se notar que estas proteínas associadas aos números EC não faziam parte do conjunto de dados original e só foram descobertas porque interagiram de alguma forma com as proteínas originais. Foram geradas duas redes principais, uma com dados da consulta da página STRING, com 70 nós e 529 arestas, e outra construída a partir de dados de todas as interações de proteínas disponíveis no banco de dados STRING, com 4.839 nós e 129.030 arestas. Percebe-se que os procedimentos sequenciais reduzem gradativamente a quantidade de proteínas disponíveis para análise, até que sejam pesquisadas no banco de dados da rede.
A partir daí, concluímos que a mineração de novas informações biológicas funcionais a partir de dados existentes é uma característica saliente do uso de redes de interação como instrumento para análise de dados de diferentes fontes.
Conteúdo do arquivo de_proteins_common_results-non-
Programa blast-extract-info.pl, utilizado para extrair diversas
Conteúdo do arquivo tcruzi_proteins_from_TcruziSylvioX10-vs-
Conteúdo do arquivo tcruzi_proteins-string_id-regulation.tsv, que
As cores indicam a categoria de cada um dos elementos, conforme etiqueta ao lado do fluxograma.
