ÓLEO ESSENCIAL DE Laurus nobilis L. LOURO) INDUZ A ATIVAÇÃO DE VIAS REATIVAS DE OXIGÊNIO E VIAS DE SINALIZAÇÃO CELULAR. Laurus nobilis L. louro (óleo essencial) causa ativação de espécies reativas de oxigênio e vias de sinalização celular durante a ação larvicida.
Aedes aegypti
- Ovos e Larvas
- Pupas e adultos
- Doenças transmitidas e o controle da disseminação do A. aegypti
- Intestino dos mosquitos
Os sinais clínicos geralmente surgem repentinamente, como febre alta, calafrios, vômitos por cerca de três dias, dores musculares, fadiga e dor de cabeça. A chikungunya ou febre chikungunya apresenta como manifestações clínicas, estado febril (acima de 38,5 ºC) de início súbito, dor intensa nas articulações das mãos e pés, incluindo dedos, punhos e tornozelos.
LOURO (Laurus nobilis L.)
O intestino médio dos mosquitos é um órgão importante em termos de aspectos biológicos dos insetos. No intestino médio, as enzimas monooxigenases responsáveis pelo metabolismo oxidativo também são encontradas em maiores concentrações, sendo responsáveis por inibir e reduzir potenciais danos causados ao inseto principalmente pela ação de radicais livres. O tubo ou ventrículo, por sua vez, é dividido em intestino médio anterior e intestino médio posterior.
Histologicamente, o intestino médio é constituído por um epitélio colunar simples com duas camadas de tecido muscular responsável pelo movimento peristáltico do órgão. A área do epitélio é composta por três tipos diferentes de células, células digestivas, de formato colunar, com microvilosidades na parte superior; células regenerativas ou células-tronco, indiferenciadas, pequenas, com ausência de grânulos de secreção no citoplasma e citoplasma eletrodenso, que atuam na renovação do epitélio e estão localizadas entre as células digestivas na parte mais basal do epitélio. E, finalmente, também existem células enteroendócrinas localizadas na parte basal do epitélio do intestino médio posterior, que podem se somar às células regenerativas, com quantidade variável conforme o desenvolvimento do animal.
Segundo Santos e Coelho (2013), estudos fitoquímicos do louro identificaram metabólitos secundários como eugenol, linalol, sabineno, limoneno, pineno, cineol, geraniol e canfeno em seu óleo essencial. Esses metabólitos são responsáveis pelo desenvolvimento de diversas atividades biológicas na planta, como defesa e proteção contra insetos, predadores, entre outros, podendo ter diversas atividades medicinais. Assim, o óleo essencial de louro foi escolhido para a análise de sua atividade larvicida sobre A.
OBJETIVO GERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
PROCEDIMENTOS E TÉCNICAS DE COLETA DOS DADOS
- Óleo essencial
- Sobrevivência
- Morfologia
- Imunofluorescência
- Estresse oxidativo
O mesmo número de larvas e a mesma quantidade de solução foram usados para o controle negativo com a solução Tween 20. Após lavagem com PBST, soluções dos anticorpos primários (coelho, policlonal) foram adicionadas a cada eppendorf: antifosfohistona H3 (PH3) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, EUA), diluição 1:100; amida anti-FMRF (Peninsula Laboratories, Inc., San Carlos, CA, EUA), diluição 1:500; anti-caspase 3 clivada (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, EUA), diluição 1:500; anti-Notch1 (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, EUA), diluição 1:200; p-ERK1/2 (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, EUA), diluição 1:200; anti-LC3 (Cell Signaling Technology Inc., Beverly, MA, EUA; produzido em coelhos), diluição 1:500, com incubação por 24 horas a 4 ºC. Posteriormente, três lavagens de 10 minutos com PBS foram realizadas e, em seguida, 0,5 μg/ml de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Biotium, Inc., Hayward, CA, EUA) foi adicionado a cada eppendorf, deixando durante a noite. .
Para cada ponto de teste realizado, foi feito um ponto em branco, então foram pipetados 10 µL de amostra para o teste e 10 µL de amostra para o branco. Para realizar o teste em branco, 5 µL de solução CDNB, 490 µL de PBS e 5 µL de solução GSH foram pipetados em uma cubeta de quartzo, homogeneizados e os resultados foram medidos em 30 se 90 s. Para a reação de análise da amostra, foram utilizados 5 µL de solução CDNB, 480 µL de PBS, 5 µL de GSH e 10 µL de amostra, homogeneizados e depois lidos a 340 nm.
Para o teste, 10 µl da amostra foram pipetados para os poços da coluna 2 e 170 µl de tampão pH 7,8 foram adicionados a todos os poços. 100 µL da solução de TBARS previamente preparada foram adicionados a 50 µL da amostra, seguido de vórtex por cerca de 10 segundos e então todos juntos incubados a 90 ºC onde permaneceram por 40 minutos. Para o ensaio, 10 µL da amostra da coluna 2 foram pipetados e posteriormente 150 µL de reagente de Bradford foram adicionados a todos os poços incluindo a curva e finalizados com uma leitura a 595 nm em um leitor de Elisa.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para a curva, 10 µL padrão 1 mg/mL BSA foram pipetados na primeira coluna no ponto A, e 10 µL padrão mais 10 µL PBS foram pipetados no ponto B, seguido de diluição em série para o ponto G e finalmente o ponto na curva (H), apenas 10 µL de PBS.
SOBREVIVÊNCIA
Segundo Fernández e cols. (2018), o componente essencial do OE apontado como responsável pelo efeito larvicida é o linanol, principalmente se coletado na primavera, pois as concentrações dos metabólitos secundários que compõem o óleo essencial podem variar dependendo da estação do ano, do solo e o local onde foi recolhido e retirar. Após a transformação em adultos e após 10 dias de observação da vitalidade do mosquito, observou-se que nenhum adulto morreu em qualquer concentração até o último dia de observação, conforme mostra a Figura 6. Durante a transformação em pupas, eles foram transferidos para gaiolas para que, quando eles se tornaram adultos, eles poderiam ser presos para facilitar a observação.
Durante a transformação em adultos, as gaiolas também foram analisadas por 10 dias para monitorar a sobrevivência dos adultos. Houve uma tendência das larvas expostas ao óleo essencial se desenvolverem um pouco mais rápido que os controles. No entanto, observou-se que em gaiolas contendo larvas expostas ao óleo, a transformação para a fase adulta foi ligeiramente mais rápida em comparação com os controles.
ALTERAÇÃO DA MORFOLOGIA DO INTESTINO MÉDIO DAS LARVAS DE A. AEGYPTI APÓS
Um epitélio organizado sem vacúolos pode ser visto nas células epiteliais; apresenta bordas estriadas bem visíveis e sem ruptura epitelial. Observou-se desorganização do epitélio celular com presença de numerosos vacúolos celulares (B, D e E), ruptura epitelial (C e E) e ausência de borda estriada na grande maioria do intestino. Segundo Snodgrass (1935), as células digestivas do intestino do inseto podem estar envolvidas nos processos de absorção e excreção de substâncias, e essa desintegração celular pode ocorrer devido ao acúmulo de material no interior das células.
Essas mudanças histológicas ajudaram a entender um pouco mais sobre como o óleo funciona em A.
EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE LOURO NO ESTRESSE OXIDATIVO
As alterações encontradas neste estudo são consistentes com os resultados de Narciso et al. Esse aumento da atividade da enzima GST no grupo controle pode ter várias causas, como quantidade de alimento, luz, entre outras, mas não são suficientes para causar a morte das larvas do grupo controle, pois possivelmente A ação da GST foi necessária para reduzir o estresse oxidativo dessas larvas, pois apenas essa enzima foi alterada no grupo controle. GST também foi alterado no grupo tratado por 24 horas em comparação com o grupo de 6 horas.
O resultado encontrado ao analisar GST no grupo tratado é compatível com os resultados obtidos no grupo tratado por Fader-Gomes e colaboradores (2021) que expuseram abelhas ao inseticida fipronil (na concentração de 0,1 ng i.a. μL-1) por 24 horas . Também foi observada diferença significativa no grupo tratado entre os tempos 6 e 24 horas quanto aos marcadores malondialdeído (MDA) e carbonila proteica quando comparado ao grupo tratado no tempo 6 horas, Figuras 10 e 11. Dados obtidos de Costa et al. 2022) que analisou a indução de estresse oxidativo pelo extrato bruto de Xylaria sp. aegypti, resultando em concentrações aumentadas de MDA e proteína carbonil nas larvas expostas ao composto.
A carbonila proteica pode ser identificada quando há oxidação das proteínas, em decorrência da atuação de radicais livres nas cadeias de aminoácidos. 2022), esse aumento de MDA encontrado em decorrência da oxidação lipídica pode estar associado a danos na membrana celular da larva, também condizente com os achados histológicos deste trabalho. Observou-se então que houve ativação das enzimas CAT, SOD e GST para reverter os danos causados pelo estresse oxidativo induzido pelos componentes do óleo. Dentre esses danos, a peroxidação lipídica pode ser apontada como a principal, causando alterações nas membranas celulares e em suas funções biológicas, o que está de acordo com os achados histológicos do presente estudo.
EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DE LOURO SOBRE VIAS CELULARES RELACIONADAS A
O número de células ERK-positivas no intestino está representado no gráfico, onde letras diferentes indicam que houve diferença significativa entre os grupos. O número de células PH3 positivas no intestino está representado no gráfico, onde letras diferentes indicam que houve diferença significativa entre os grupos. O número de células JNK positivas no intestino está representado no gráfico, onde letras diferentes indicam que houve diferença significativa entre os grupos.
O número de células FMRF positivas no intestino é mostrado no gráfico, onde letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos. O número de células Armadillo positivas no intestino é mostrado no gráfico, onde letras diferentes indicam uma diferença significativa entre os grupos. O número de células WNT-positivas no intestino é mostrado no gráfico, onde letras diferentes indicam uma diferença significativa entre os grupos.
O número de células Prospero-positivas no intestino é mostrado no gráfico, onde letras diferentes indicam que houve diferença significativa entre os grupos. O número de células positivas para Notch1 no intestino é mostrado no gráfico, onde letras diferentes indicam que houve diferença significativa entre os grupos. O número de células Delta positivas no intestino é mostrado no gráfico, onde letras diferentes indicam que houve diferença significativa entre os grupos.
O número de células positivas para caderina no intestino está representado no gráfico, onde letras diferentes indicam que houve diferença significativa entre os grupos. O número de células positivas para Casp 3 no intestino está representado no gráfico, onde letras diferentes indicam que houve diferença significativa entre os grupos.
