PRODUÇÃO DE CELULASE POR Myceliophthora thermophila I-1D3b EM RESPOSTA A DIFERENTES FONTES DE CARBONO E QUANTIDADES DE AERAÇÃO. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi analisar experimentalmente o efeito de diferentes fontes de carbono e taxas de aeração sobre a capacidade de ativar ou inibir a produção de celulases pelo fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b em estado sólido (CES) e culturas submersas. (CSm).
INTRODUÇÃO
Na natureza, fungos termofílicos regulam seu metabolismo com os nutrientes disponíveis no ambiente para melhor crescimento (GOMES et al., 2020). Os principais compostos utilizados como fontes de carbono são os monossacarídeos (glicose, frutose e galactose) e os dissacarídeos (maltose e sacarose) (SANTOS et al., 2013).
OBJETIVOS
Objetivos específicos
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
- Energia renovável e a importância do biocombustível
- Biomassa lignocelulósica
- Produção atual
- Etanol celulósico
- Enzimas celulolíticas
- Cultivo em estado sólido (CES) e submerso (CSm) na produção de enzimas
- Cultivo em estado sólido (CES)
- Cultivo submerso (CSm)
- Microrganismos utilizados nos processos fermentativos
- Potencial de Myceliophthora thermophila para produção de celulase
- Influência de fontes de carbono e aeração na produção de celulases
- Aeração
O custo das enzimas nesse processo é calculado em dólares/litro de etanol celulósico (KLEIN-MARCUSCHAMER et al., 2012). Trichoderma harzianum PBLA Serragem de pinho Lopez- Ramirez et al. de trigo Frassatto et al.
MATERIAIS E MÉTODOS
- Microrganismo
- Solução nutriente e caldo de cultivo
- Substratos
- Avaliação do efeito das fontes de carbono
- Cultivos em estado sólido em embalagens plásticas
- Cultivos submersos em frascos de Erlenmeyer
- Análise do efeito de adição de compostos ao meio de preparo do inóculo
- Testes com soro de leite em cultivos sólido e submerso
- Caracterização do soro de leite
- Efeito da adição de soro de leite sobre o crescimento do microrganismo e a atividade de
- Efeito da aeração em biorreatores
- Cultivos em estado sólido em biorreator de leito empacotado (BLE)
- Monitoramento da temperatura
- Umidade
- Cultivos submersos em biorreator de tanque agitado aerado (TAA)
- Determinações analíticas
- Concentração de proteínas solúveis
- Atividade de endoglucanase e papel de filtro
- Atividade específica
- Cálculo de parâmetros de cultivo
- Análise respirométrica
- Análises estatísticas
A determinação da concentração de lactose no soro de leite foi realizada pelo método dos açúcares redutores totais DNS (ácido 1,3-dinitrosalicílico), adaptado do descrito por Miller (1959). Efeito da adição de soro de leite no crescimento microbiano e na atividade da endoglucanase (CMCase). O soro de leite foi esterilizado separadamente a 121oC por 15 minutos e adicionado assepticamente ao meio de cultura.
Esquema experimental de culturas sólidas e submersas com adição de soro de leite em escama de frasco. A atividade da endoglucanase (CMCase) foi determinada de acordo com o método adaptado de Ghose (1987), segundo o qual 0,1 mL da amostra e 0,9 mL de uma solução 4% (p/v) de carboximetilcelulose (CMC) em tampão acetato 0,1 M com pH 5,0. 10 minutos a 60°C em banho termostático e a reação foi interrompida pela adição de 1 mL do reagente DNS (ácido 1,3-dinitrosalicílico). A quantidade cumulativa de CO2 produzido (Ci) foi calculada pela equação 4.5 a partir da área sob a curva de concentração de CO2 em função do tempo de cultivo (FAVARO et al. 2020).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Avaliação do efeito indutor de diferentes fontes de carbono
- Efeito indutor no cultivo em estado sólido
- Efeito indutor no cultivo submerso
A adição de nutrientes sintéticos ao meio pode, portanto, promover o crescimento celular e induzir a produção de enzimas. As demais fontes de carbono prejudicaram a produção de endoglucanase em relação ao controle, o que pode ser explicado pela supressão enzimática na via metabólica para a produção desse tipo de enzima. No cultivo de fungos filamentosos, a disponibilidade de fontes de carbono mais facilmente metabolizáveis regula a produção de enzimas hidrolíticas. 2020), a lactose deve mimetizar substâncias presentes no ambiente que indiquem a disponibilidade de biomassa vegetal ao fungo.
Atividade da endoglucanase (CMCase) na presença de diferentes fontes de carbono e respectivas concentrações em cultura submersa. Pode-se observar pela Tabela 5.2 que dentre as fontes de carbono utilizadas, assim como no CES, a lactose proporcionou maior biossíntese da atividade da endoglucanase na concentração de 15 g.L-1, atingindo U/gss. De acordo com De Vries et al. 2011), fontes de carbono facilmente metabolizadas, como glicose e sacarose, suprimem a síntese de celulases, que são responsáveis pela quebra de vários polissacarídeos.
Avaliação da suplementação de meios de preparo de inóculo
Essa vantagem se estende à produção de enzimas, que proporciona maiores atividades em relação ao processo de cultivo submerso (GOMES et al., 2020), conforme observado neste trabalho. 1960) também confirmou comportamento semelhante para a produção de celulases pelo fungo Trichoderma viride e pelo basidiomiceto QM806. Diante dos resultados encontrados, é possível concluir que a adição de lactose ao meio de fermentação teve influência positiva direta no metabolismo responsável pela produção da enzima. Ressalta-se também que, embora a lactose seja a única fonte de carbono de origem animal utilizada, ela não apresenta risco de conter príons que possam afetar a produção futura de BE2G (GOMES et al., 2020).
Assim, na sequência deste trabalho, foram realizadas culturas em biorreatores variando a taxa de aeração, estabelecendo a adição de lactose 15 g.L-1 na solução nutritiva ou no caldo de cultura, considerando que esta concentração proporciona os melhores resultados de indução de endoglucanase proporcionados. produção de enzimas. Portanto, comparando os resultados dos testes em cultura sólida e subaquática, é possível observar que ambas apresentaram maiores valores de produção de CMCase no meio composto pela solução salina de Zanelato et al. 2012) incluído a partir da lactose, mostrando diferença significativa para o meio sem lactose para quase todos os testes. Em relação ao meio de cultura, optou-se por continuar utilizando a solução nutritiva de Zanelato et al. 2012) mais 15g.L-1 de lactose para testes de scale-up para biorreatores, pois é um meio com menor teor de sais utilizado, o que pode reduzir o custo em uma possível utilização em escala industrial, como etapa a adição.
Planejamento experimental fatorial 2 2
Na Figura 5.4 (a) e (b), são apresentados os gráficos de Pareto para avaliação dos efeitos das variáveis independentes nas respostas dos testes fixo e submerso. Com base na Figura 5.4 (a) e (b), é possível confirmar que as variáveis proporção de substrato e concentração de lactose em ambas as culturas apresentaram influência significativa em relação à resposta do teste, em termos lineares. A literatura relata alguns estudos mostrando a influência dessas variáveis independentes na produção de enzimas (SADHU et al. 2013; LUGANI et al. 2015; SHAJAHAN et al. 2017).
A interação entre concentração e composição do substrato não apresentou influência estatisticamente significativa para o intervalo de confiança de 95%. Com base nos dados obtidos, é possível observar que a concentração tem efeito negativo, indicando que aumentar a concentração de lactose para valores superiores a 15 g.L-1 não aumenta o efeito indutor da produção da enzima, o mesmo ocorre por aumentar a proporção de bagaço de cana na composição do substrato de 9:1, indicando que existe uma faixa ideal para a produção de endoglucanases, que acima ou abaixo de 7:3 a produção é inibida. Com relação à concentração de lactose, nossos resultados concordam com os de Gomes et al. 2020), enquanto os resultados concordam com Zanelato et al.
Cinética de crescimento de M. thermophila em cultivo em estado sólido
Na Figura 5.5, pode-se observar que a curva cinética apresenta um comportamento crescente semelhante aos estudos de Casciatori et al. Zanelato (2011) cultivou o fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b nos mesmos substratos e condições deste trabalho, por 144 horas. O autor observou que a atividade da endoglucanase adquirida aumenta acentuadamente durante as primeiras 48 horas de cultivo e se estabiliza após 96 horas.
O maior valor da atividade da endoglucanase foi alcançado após 96 horas com um valor de 260,84 U/gss. Esse resultado está de acordo com o previsto por Rodrigues et al. 2020) que determinou um tempo de 96 h como ótimo para a recuperação de endoglucanase de ESCs deste mesmo microrganismo a 45 °C usando o mesmo. Esses dados são importantes, por exemplo, para determinar o menor tempo de cultivo dos fungos que apresentaram maior taxa de crescimento (BENOCCI et al. 2017; SAMAL et al. 2017; FAVARO et al. 2020).
Teste com soro de leite como fonte de lactose
- Caracterização do soro de leite
Além disso, através deste método foi possível quantificar a concentração de lactose na amostra de soro de leite in natura e após realizar uma etapa de concentração de sólidos solúveis no material. Avaliação da suplementação de soro de leite no crescimento microbiano e na atividade da endoglucanase (CMCase). As culturas sólida e de imersão foram realizadas com soro de leite natural e concentrado como fonte de carbono em substituição à lactose sintética (comercial).
2015) avaliou o uso de permeado de soro de leite e observou comportamento semelhante de produção de enzimas em culturas sólidas. Utilizando soro de leite como fonte de carbono para a produção de uma protease alcalina a partir de um novo isolado de Bacillus sp. Ao avaliar os experimentos realizados com o soro de leite na concentração de 8 g.L-1 (in natura), observa-se uma menor atividade enzimática em relação à concentração de 15 g.L-.
Avaliação do efeito da taxa específica de aeração em biorreatores
- Cultivos em estado sólido em biorreator de leito empacotado (BLE)
- Resultados térmicos dos cultivos
- Análise respirométrica
- Umidade
- Proteínas solúveis
- Cultivos submersos em biorreator tipo tanque agitado aerado (TAA)
- Atividades enzimáticas e concentração de proteínas solúveis
- Análise respirométrica
Constantes específicas de produção de CO2 de acordo com taxas de aeração em BLE. Produção de proteína solúvel e atividade específica de acordo com taxas de aeração em BLE. A Figura 5.12 mostra em duplicata os perfis de concentração de CO2 em função do tempo de cultivo e taxa de aeração.
A Figura 5.13 apresenta os ajustes duplicados do modelo de regressão logística para os dados de CO2 acumulado em experimentos de cultivo submerso sob taxas de aeração de 1 e 0,5 vvm, respectivamente. Ajuste o modelo de regressão logística aos dados de CO2 acumulados em duplicata do biorreator TAA para as duas taxas de aeração. Na Tabela 5.12 são apresentados os valores médios das taxas específicas de produção de CO2 (μ) para ambas as taxas de aeração.
Comparação dos rendimentos aparentes dos cultivos em biorreatores
Tais resultados estão de acordo com os obtidos por Rodrigues (2021), que estimou o valor de μ em 0,07 h-1 para M. thermophila I-1D3b com taxa de aeração próxima a 1 vvm. 2020) avaliou experimentalmente a cinética de crescimento de Myceliophthora thermophila M.7.7 determinando a concentração de N-acetilglicosamina também em BC:FT 7:3 m/m e obteve um valor μ de 0,120 h-1, mas essa discrepância pode estar relacionada a a diferença entre os métodos de avaliação indireta de biomassa. Com base nas atividades relatadas neste trabalho e neste estudo, pode-se dizer que a suplementação do caldo de cultivo e as condições de aeração propostas neste trabalho favorecem maior produção de endoglucanase em cultivo submerso em tanque aerado com agitação. Como a concentração inicial de lactose em ambos os meios foi a mesma, foi possível determinar a influência direta do grau de aeração na produtividade do sistema.
Ao crescer em meio sólido e submerso, verificou-se que uma taxa de aeração de 1 vvm proporcionou uma melhora no valor do rendimento aparente da enzima com maior transferência de oxigênio para o meio de cultivo, o que também promoveu uma melhor remoção do dióxido de carbono produzido durante a safra. Esses resultados estão de acordo com os trabalhos relatados por Meneghel (2013) e Reginatto (2016) que mostraram que os valores de rendimento aparente para culturas de Aspergillus foram maiores nos ensaios em que foram observadas as maiores atividades enzimáticas e que a mistura e o calor e a transferência de massa foi mais eficiente com os maiores valores de aeração, relatando um aumento de 0,67 U/mg para testes sem agitação para 0,83 U/mg utilizando agitação em biorreatores, valores próximos aos encontrados no atual trabalho utilizando uma aeração taxa de 1,0 vvm para dois métodos de cultivo. 2015) também verificou que o crescimento de A. Assim, nas condições utilizadas neste estudo, pode-se definir que o cultivo em estado sólido utilizando uma taxa de aeração de 1,0 vvm incorporada a partir de lactose com um agente de indução na concentração de 15 g.L- 1 apresentou as melhores condições de crescimento.
CONCLUSÕES
O mesmo comportamento foi observado usando um biorreator tanque agitado aerado para cultivo submerso, com maior produção enzimática sob 1 vvm de aeração.
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Sequential solid and submerged cultivation of Aspergillus niger on sugarcane bagasse for cellulase production. Development of solid state fermentation for the production of biomass degradation enzymes for the bioenergy sector. Development of solid-state fermentation for the production of biomass-degrading enzymes for the bioenergy sector.
Recent advances in the production of lignocellulolytic enzymes by solid-state fermentation of agro-industrial wastes. Production of cellulases by solid state fermentation using natural and pretreated sugarcane bagasse with different fungi. Solid state fermentation technology and innovation for the production of agricultural and animal feed bioproducts.
