Rompimento não-Mecânico
1) Choque Osmótico
Não ocorre rompimento total das células;
Pode propiciar a permeabilização seletiva;
As células são mantidas por 30 minutos em meio com
concentração de sacarose de ~20% (m/v), separadas por centrifugação e ressuspensas em água destilada a 4ºC.
Mais indicado para bactérias Gram-negativas, pois possuem parede celular mais sensível que as Gram-positivas.
Rompimento total e permeabilização seletiva
Congelamento-descongelamento
As células passam por repetidos ciclos de
congelamento e descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem perfurar a célula e provocar seu total rompimento ou lesioná-la
formando poros permeáveis à biomolécula-alvo.
Fatores que mais influenciam:
tipo e idade da célula;
Temperatura
Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;
Congelamento-descongelamento
Método de difícil implantação em grande escala
Enzimas sensíveis ao congelamento podem
ser inativadas
Termólise
Consiste no aquecimento da suspensão celular em banho
termostatizado, com injeção direta de vapor, tambor rotativo ou em spray-drier.
Sãos os mais utilizados para rompimento em larga escala devido à sua simplicidade;
Principalmente utilizados para algas, fungos filamentosos, leveduras e bactérias destinadas à produção de proteína microbiana;
Apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores dimensões e, portanto, de mais fácil remoção por filtração ou centrifugação.
Termólise
Exemplos:
Rompimento total de células de uma suspensão de E. coli (bactéria Gram-negativa), ocorre com
aquecimento a 90 ºC por 15 minutos com liberação de enzimas intracelulares
Uma suspensão de Bacilus megaterium nas
mesmas condições proporciona o rompimento de menos da metade das células (bactéria Gram-
positiva- camada mais espessa de peptideoglicano)
Rompimento Químico
Álcalis:
Adequado quando a molécula-alvo é estável em pH maior que 11
Método simples e de baixo custo;
Ocasiona geração de poluentes;
Rompimento Químico
Detergentes:
São capazes de dissociar proteínas e lipoproteínas das paredes celulares,
provocando a formação de poros e liberar a molécula-alvo;
A célula pode ser totalmente rompida;
Ex.: lauril sulfato de sódio, Triton, etc.
Formação de espuma e desnaturação e/ou
precipitação de proteínas
Rompimento Químico
Solventes:
Consiste na desidratação das células, sendo os solventes mais utilizados o etanol, metanol, tolueno e acetona;
Adequado para biomoléculas que não sejam desnaturadas na presença do solvente
empregado;
Rompimento Químico
Lise enzimática:
Mecanismo de rompimento: membrana citoplasmática é rompida pela pressão osmótica interna, após a parede
celular, ou parte dela, ser removida por ação das enzimas, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado.
Adequado para recuperação de biomoléculas sensíveis ao rompimento mecânico, temperatura, tensão de
cisalhamento e elevadas pressões.
Fatores a ser considerados: presença de inibidores, possibilidade de reciclo da enzima.
Rompimento Químico
Sistema enzimático deve ser adequado para cada tipo de microrganismo:
Leveduras: glucanases, proteases e
mananases, as quais hidrolisam componentes específicos da parede, como glucanas,
proteínas e mananas.
Bactérias Gram-negativas: enzimas que ajam sobre as ligações covalentes da estrutura do peptideoglicano
Parede Celular Bacteriana Peptideoglicano
Ex.: lisozima, catalisa a hidrólise das ligações glicosídicas do peptideoglicano, mais eficiente no rompimentos de
bactérias Gram-positivas.
Preservação da Biomolécula-alvo
Adição de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da degradação de proteínas);
Adição de agentes redutores (para evitar a oxidação dos sítios ativos das enzimas após o rompimento);
Adição de nucleases ou proteases podem melhorar as características do meio, desde que não destruam a molécula de interesse;
Alteração de pH pode melhorar a viscosidade do meio.
Etapas de um Processo de Purificação
Baixa
resolução Alta
resolução
Métodos de Purificação de Baixa Resolução
Precipitação
Separação por membranas
Extração em sistemas de duas fases líquidas
Precipitação
Precipitação
Um dos métodos mais tradicionais de concentração e purificação;
É um método moderado de purificação já que não apresenta elevada capacidade de separação de diferentes proteínas;
Métodos agressivo para recuperação de proteínas, pois sua função tridimensional é modificada, e a função bioquímica de uma proteína depende de sua estrutura;
É viável quando a função bioquímica é recuperada após a precipitação
Precipitação
Precipitante Princípio Vantagens Desvantagens
Sais neutros
(Salting-out) Interações hidrofóbicas pela redução da camada de hidratação da proteína
- Uso universal - Corrosivo
- Baixo custo - Liberação de amônia em pH alcalino Polímeros não-iônicos Exclusão da proteína da fase
aquosa reduzindo a quantidade de água disponível para a solvatação da proteína
- Uso de pequenas
quantidades de precipitante - Aumento da viscosidade
Calor interações hidrofóbicas e
interferência das moléculas de água nas ligações de hidrogênio,
- Baixo custo - Risco de desnaturação - Simples
Polieletró-litos Ligação com a molécula de proteína
atuando como agente floculante - Uso de pequenas
quantidades de precipitante - Risco de desnaturação Precipitação isoelétrica Neutralização da carga global da
proteína pela alteração do pH do meio
- Uso de pequenas
quantidades de precipitante - Risco de desnaturação
Sais metálicos Formação de complexos - Uso de pequenas
quantidades de precipitante - Risco de desnaturação Solventes orgânicos Redução da constante dielétrica do
meio aumentando as interações eletrostáticas intermoleculares
- Facilidade de reciclagem - Risco de desnaturação de proteínas - Facilidade na remoção do
precipitado - Inflamável e explosivo
Estrutura das Proteínas
Constituição
Aminoácidos (aa) com elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as proteínas.
Os 20 aa das proteínas se diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o caráter ácido ou básico do aa em solução.
Estrutura das Proteínas
Estrutura primária: refere-se à seqüência dos aminoácidos na cadeia linear peptídica.
Estrutura secundária: refere-se ao grau de ordenação espacial da cadeia polipeptídica. São estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.
Estrutura das Proteínas
Estrutura terciária: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundária.
Envolve a otimização de várias interações (hidrofóbicas, eletrostáticas e de van der Waals) e pontes de hidrogênio entre vários grupos na estrutura da proteína.
As estruturas secundária e terciária
conferem à proteína a sua estrutura
tridimensional.
Estrutura das Proteínas
Estrutura quaternária: envolve a associação de subunidades terciárias de proteínas.
Para sua estabilização concorrem ligações
iônicas, pontes de hidrogênio, forças de
van der Waals, pontes bissulfeto e
interações hidrofóbicas.
Solubilidade de Proteínas
Região Hidrofóbic
a (Apolar) Regiões Hidrofílicas (Polares)
Determina sua solubilidade
Além dos aa, íons ferro e cobre,
oligossacarídeos e lipídeos conferem
diferentes solubilidades às proteínas.
Solubilidade: resultado global das interações atrativas e repulsivas entre moléculas do solvente e soluto;
É favorecida quando há interações repulsivas entre moléculas de soluto e atrativas entre moléculas do soluto e solvente;
Interações entre soluto e solvente são não covalentes => interações eletrostáticas e forças de Van der Waals;
pH: grande influência => altera o grau de dissociação dos grupamentos;
Carga total zero leva ao da agregação devido à repulsão => perfis de solubilidade em diferentes valores de pH
O ponto de solubilidade mínima é igual ou próximo ao ponto isoelétrico (pI), que
corresponde ao valor de pH no qual a proteína possui carga global igual a zero.
pH e distribuição de cargas:
pI
- - + +
De modo geral, o solvente é aquoso, e,
alterando-se as propriedades do meio
por mudanças na força iônica e no pH, por
adição de solventes orgânicos miscíveis e
polímeros orgânicos, altera-se a
solubilidade das proteínas.
Desnaturação X Precipitação
A desnaturação compreende a destruição da estrutura terciária de uma molécula de proteína e a formação de cadeias polipeptídicas ao acaso.
- as variáveis pH, temperatura e solventes orgânicos, dependendo dos valores, causam desnaturação das proteínas.
A precipitação compreende a modificação da estrutura tridimensional da molécula de proteína.
- as mesmas variáveis, dependendo dos
valores, causam precipitação das proteínas.
A precipitação deve permitir que a
conformação adequada da proteína
seja recuperada, para que a
mesma possa “exercer” sua função
bioquímica após o processo.
Precipitação por sais
Neutralização das cargas superficiais com redução da camada de hidratação
Salting-out: adição de sais que promovem o aprisionamento de moléculas de água que tornam-se escassas e o consequente consumo das moléculas de água nas regiões hidrofóbicas, que expostas interagem e se agregam.
Os sais mais adequados são aqueles que apresentam elevada solubilidade, ex.: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio.
Salting-in: redução na concentração de sais induz interações iônicas e agregação entre moléculas de proteína.
Método mais comumente usado para separação de proteínas é o da adição de sais neutros (salting out)
Globulinas se precipitam sob força iônica
baixa
Precipitação por solventes
A solubilidade das proteínas varia com a distribuição dos resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos na superfície da molécula;
Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e outros:
precipitantes;
Deve ser miscível em água, não reagir diretamente com as moléculas e ser bom precipitante;
Mais usados: metanol, etanol e acetona;
Mecanismo
Agregação de proteínas por interações eletrostáticas entre superfícies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgânico.
Variáveis que afetam o processo
Temperatura: 20 – 30 ºC estimulam a desnaturação < 0º C podem garantir que não haja desnaturação
adição do solvente temperatura
=> deve ser lenta e sob
refrigeração
pH: próximo ao pI favorece a
precipitação
Precipitação por polímeros
PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar, neutro e miscível em água, disponível em diversos graus de polimerização;
Em geral, proporções de polímero (15 a 30%);
4000 g/mol ou mais são os mais eficientes
Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso;
Concentração depende do tamanho da molécula a ser precipitada e da massa molar do polímero, sendo inversamente proporcional à concentração da proteína;
Remoção do polímero: ultrafiltração, adição de etanol, separação pela formação de duas fases aquosas pela adição de sais.
Polieletrólitos:
polímeros iônicos solúveis em água; usados devido ao baixo custo e pouca concentração residual; Policátion polietilenoimina e poliânion ácido poliacrílico, utilizados para precipitar ácidos nucléicos e proteínas.
Mecanismo: Ocorre a agregação à proteína (floculação) ou eletrostático (neutralização de cargas); a proteína e o polieletrólito devem ter cargas opostas , por isso, deve-se operar longe do ponto isoelétrico da proteína.
Precipitação pela temperatura
Mecanismo:1) diminuição: redução na solubilidade; 2) aumento: desnaturação =>
exposição de grupos hidrofóbicos que
interagem e formam complexos insolúveis;
Precipitação isoelétrica
Resulta da atração eletrostática das proteínas quando estas estão próximas a seu pI;
Método bastante simples: ajuste do pH
Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima => precipitação isoelétrica, por interação entre as zonas hidrofóbicas;
Vantagem: baixo custo
Desvantagem: possibilidade desnaturação
