XXVII Congresso de Iniciação Científica
Síntese de peptídeos modificados para otimização do teste in chemico DPRA
Larissa Pires Pereira, Eduardo Maffud Cilli, Eduardo Festozo Vicente. UNESP/Campus de Tupã, Curso de Engenharia de Biossistemas, laripires2010@hotmail.com, Bolsa BAEE I.
Palavras Chave: Síntese peptídica em fase sólida, DPRA, otimização.
Introdução
Peptídeos são biomoléculas constituídas por dois ou mais resíduos de aminoácidos, unidos por meio de ligações covalentes, denominadas ligações peptídicas que ocorrem entre os grupos amina e ácido carboxílico dos aminoácidos envolvidos.1 Para a obtenção destas moléculas, utilizamos a síntese peptídica em fase sólida (SPFS), método que baseia-se no crescimento, resíduo por resíduo, da cadeia peptídica presa covalentemente a um suporte polimérico sólido (resina). Esta resina é inerte e insolúvel nas condições utilizadas na SPFS.
Desta forma, o método é rápido e vantajoso, além de permitir a purificação dos produtos por meio de um simples processo de filtração dos reagentes em excesso e subprodutos, garantindo um maior rendimento das reações.2 Um novo método envolvendo peptídeos foi desenvolvido pela OECD chamado DPRA (Direct Peptide Reactivity Assay) tem por finalidade quantificar a concentração de peptídeo específico restante (contendo lisina ou cisteína) após a incubação a 25 º com o produto químico a ser testado. O teste vem sendo utilizado como parte de novos métodos in chemico para substituição completa dos testes de sensibilização em animais.
Objetivos
O objetivo deste trabalho é de implementar a síntese peptídica em fase solida (SPFS) no Campus de Tupã e modificar a sequência dos peptídeos padrão do teste in chemico DPRA de modo que estas novas moléculas otimizem e tornem o teste mais sensível à detecção.
Materiais e Métodos
Foram utilizados a resina Wang Fmoc-Val Wang resin, os solvente DMF (dimetilformamida), DCM (diclorometano), solução de piperidina (20% em DMF) e os agentes acoplantes HBTU (O- Benzotriazollil-N,N,N-tetrametilurônio-
hexafluruofosfato) e DIEA (N-
Diisopropilicarbodiimida). O teste de Kaiser foi utilizado para a verificação do acoplamento dos aminoácidos.3 O peptídeo foi sintetizado pelo método da síntese peptídica em fase sólida, utilizando a Wang resina com grau de substituição inicial de 0,67 mmol/g, a qual já possuindo o
primeiro aminoácido acoplado (valina). O processo foi iniciado com a lavagem da resina usando os solventes DMF e DCM. Após isto, foi feita a desproteção dos grupos protetores Fmoc, utilizando a solução de piperidina por 1 minuto; descartamos, e repetimos o procedimento aumentando o tempo para 20 minutos. O próximo passo foi a pesagem do aminoácido e do agente acoplante HBTU:
dissolvemos os mesmos em pequena quantidade de DMF e adicionou-se DCM. Adicionamos a base DIEA, que é necessária para ativação dos reagentes e agitou-se a reação por aproximadamente 120 minutos. Nesta etapa de acoplamento, foi utilizado um excesso de 3 vezes de aminoácidos em relação a resina inicial, bem como os agentes acoplantes HBTU e DIEA. Após esse período, realizou-se novamente a lavagem da resina com os solventes DMF e DCM; secou-se por 5 minutos e realizou-se o teste de ninidrina3 para monitorar a eficiência do acoplamento.
Resultados e Discussão
O peptídeo sintetizado (Ac-RWVVCVV-CCOH) possui sequência primária modificada em relação aos peptídeos propostos no método DPRA buscando a otimização do mesmo. Para isso, as alterações realizadas foram: substituição das alaninas por valinas, deixando o peptídeo mais hidrofóbico; e a substituição da fenilalanina por um triptofano, o que torna a aumenta a fluorescência da molécula devido ao seu maior rendimento quântico.
Conclusões Parciais
O peptídeo ainda precisa ser purificado e caracterizado para que os estudos de otimização do teste DPRA sejam continuados.
Agradecimentos
Agradeemos ao IQ de Araraquara/UNESP (Prof.
Eduardo M. Cilli) pela disponibilidade do Laboratório e ao Prof. Dr. Eduardo F. Vicente pela confiança e ajuda durante esse processo.
__________
1Lehninger, A. L.; Nelson, D. L., Cox; M. M., Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman: Nova Iorque, 2005;
Vol. 4ª edition
2 Cespedes, G. F., Vicente, E. F.; Cilli, E. M. Uso da FTIR na obtenção das resinas e na síntese de peptídeos. Quim. Nova, Vol. XY, No 00, 1-6, 2011.
3 Wellings, D. A.; Atherton, E. “Methods in Enzymology Volume 289: Solid-Phase Peptide Synthesis” Ed. Fields, G. B. Academic Press, San Diego, 1997, p. 54.
