3-Sequenciamento de aminoacidos

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Determina

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1ª Etapa: Determinação da composição em aminoácidos

Hidrólise de todas as ligações peptídicas do polipeptídeo puro. A mistura obtida é analisada por cromatografia de troca iônica, para determinação dos aminoácidos presentes e das suas proporções relativas.

2ª Etapa: Identificação dos resíduos amino-terminal e carboxila-terminal.

Resíduo Amino-terminal (utilizando 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno ou cloreto de dansil)

1-fluor-2,4-dinitrobenzeno + peptídeo → 2,4-dinitrofenil-peptídeo

HCl 2,4-dinitrofenil-aminoácido (resíduo N-terminal) + aminoácidos livres

O resíduo de aminoácido N-terminal ligado ao 2,4-dinitrofenil é identificado por comparação cromatográfica com padrões de derivados dinitrofenilados dos diferentes aminoácidos.

NO2

F NO2

1-fluor-2,4-dinitrobenzeno NO2

NO2

F

1-fluor-2,4-dinitrobenzeno

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O dansil-aminoácido é fortemente fluorescente. Pode ser detectado e dosado em concentrações muito menor que os dinitrofenil-aminoácidos.

Cloreto de dansil + peptídeo → dansil-peptídeo ^HCl

dansil-aminoácido (resíduo N-terminal) + aminoácidos livres

Cl

O S O

N

H₃C CH₃

Cloreto de Dansil

Resíduo Carboxila-terminal

Utilizando a enzima carboxipeptidase que hidrolisa a ligação peptídica a partir da ponta carboxila-terminal da cadeia.

Determinando qual aminoácido é liberado em primeiro lugar pela ação da carboxipeptidase, identifica-se o resíduo C-terminal no polipeptídeo.

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3ª Etapa: Fragmentação da cadeia polipeptídica (hidrólise seletiva)

Tripsina - hidrolisa as ligações peptídicas das quais participa a carboxila de resíduos de arginina ou lisina.

Um polipeptídeo com cinco resíduos de arginina e/ou lisina deverá produzir seis peptídeos menores. Com exceção de um, todos terão arginina ou lisina na posição C-terminal.

Quimotripsina - hidrolisa as ligações peptídicas cujo grupo carboxila pertence a resíduos de fenilalanina, triptofano e tirosina.

Mapa peptídico - Separação dos fragmentos produzidos por cromatografia de troca iônica em coluna, por eletroforese em papel ou por cromatografia em duas dimensões

1ª eletroforese

→

2ª cromatografia ↑↑↑↑

origem

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4ª Etapa: Determinação da seqüência dos fragmentos peptídicos

O método de degradação de Edman marca e remove apenas o resíduo N-terminal de peptídeos, deixando intacta todas as outras ligações peptídicas.

Após a remoção e identificação do resíduo N-terminal, o novo resíduo N-terminal exposto pode ser marcado e removido pela repetição da mesma reação.

Desta maneira, resíduo a resíduo, a degradação de Edman pode elucidar a seqüência inteira de aminoácidos de um peptídeo.

Fenilisotiocianato + peptídeo ^OH feniltiocarbamoil-peptídeo ^HCl

feniltiohidantoína (derivado do resíduo N-terminal) + peptídeo original (sem o resíduo N-terminal)

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Permanece, entretanto, o problema de determinar como esses fragmentos são arranjados na cadeia polipeptídica original.

O resíduo de aminoácido N-terminal na

feniltiohidantoína é identificado por cromatografia.

Seqüências contendo até 20 aminoácidos podem ser facilmente identificadas.

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5ª Etapa: Fragmentação da cadeia polipeptídica por um segundo método

Brometo de Cianogênio - quebra apenas as ligações peptídicas nas quais o grupo carboxila pertence ao resíduo metionina.

Assim, se o polipeptídeo contem 8 resíduos de metionina, a quebra com o brometo de cianogênio deverá produzir nove fragmentos peptídicos. Os fragmentos são separados por eletroforese ou cromatografia

Temos agora dois grupos de fragmentos peptídicos, um obtido pela ação da tripsina e outro pela quebra química com o brometo de cianogênio.

6ª Etapa: Ordenação dos fragmentos peptídicos através da determinação de superposições A superposição de porções dos peptídeos obtidos na 2ª fragmentação indica a ordem

correta dos peptídeos obtidos na 1ª fragmentação.

Às vezes a 2ª quebra falha em estabelecer superposições para dois ou mais peptídeos da 1ª quebra. Neste caso, uma terceira ou mesmo quarta quebra por métodos diferentes deve ser utilizada.

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Exemplo: Resultados obtidos utilizando hidrólises seletivas com tripsina e quimotripsina.

Resíduos terminais: N-terminal = Ser C-terminal = Gli

1º grupo de fragmentos Ser-Asn-Tre-Trp-Arg

Val-Lys

Tyr-Cys-Arg

Leu-Ile-Lys

Phe-Asp-Gli 2º grupo de fragmentos

Ser-Asn-Tre-Trp

Arg-Val-Lys-Tyr

Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe

Asp-Gli Seqüência deduzida

Ser-Asn-Tre-Trp-Arg-Val-Lys-Tyr-Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe-Asp-Gli

Fragmentos da 1ª quebra (c/ tripsina): Fragmentos da 2ª quebra (c/quimotripsina):

Ser-Asn-Tre-Trp-Arg Ser-Asn-Tre-Trp

Tyr-Cys-Arg Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe

Phe-Asp-Gli Asp-Gli

Leu-Ile-Lys Arg-Val-Lys-Tyr

Val-Lys

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Especificidade de alguns métodos importantes de fragmentação seletiva de cadeias polipeptídicas

Metionina (extremidade C-terminal) Broneto de

Cianogênio

Leucina, isoleucina, valina (extremidade N-terminal) Termolisina

Fenilalanina, Triptofano, Tirosina e outros (extremidade N-terminal)

Pepsina

Fenilalanina, Triptofano, Tirosina (extremidade C-terminal) Quimotripsina

Lisina, Arginina (extremidade C-terminal) Tripsina

Ponto de quebra Tratamento