Geral
Específicos
Seleção da amostragem
Foram selecionadas 125 amostras bacterianas do Complexo Burkholderia cepacia (CBc) da coleção bacteriana do Laboratório 2 do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia (DMIP) da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Universidade do Estado do Rio de Janeiro ( UERJ), abrangendo o período de coleta de janeiro de 2014 a fevereiro de 2016. As amostras armazenadas no almoxarifado eram provenientes de diversas amostras clínicas (secreção orofaríngea, escarro e sangue) processadas no Laboratório de Bacteriologia (LABACT) do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE). ), conforme protocolos microbiológicos específicos utilizados por este laboratório (ITA-BAC-010/2015 FC/LABACT/HUPE). As amostras bacterianas utilizadas no estudo foram provenientes de pacientes com FC atendidos no Ambulatório de Fibrose Cística, localizado na Policlínica Piquet Carneiro (PPC), pertencente ao Departamento de Doenças Torácicas, Disciplina de Pneumologia do HUPE e também do Instituto Nacional de Saúde da Mulher. . , da Criança e Adolescente Fernandes Figueiras (IFF) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ).
Ambos centros de referência em FC no estado do Rio de Janeiro, atendendo pacientes adultos e pediátricos respectivamente. A partir da coleta de dados da coleta de bactérias no Laboratório 2 do DMIP, foram obtidas amostras bacterianas em estoque e coletadas informações referentes às culturas selecionadas, tais como: nome do paciente, centro de referência, número de registro do paciente na instituição de saúde, data de coleta, número de registro interno atribuído à amostra, amostra clínica e identificação preliminar dos microrganismos realizada por métodos fenotípicos e submissão a testes de sensibilidade aos antimicrobianos, quando aplicável pelo LABACT do HUPE. O presente estudo foi submetido ao comitê de ética do Hospital Universitário Pedro Ernesto pela Plataforma Brasil (Ministério da Saúde - Conselho Nacional de Saúde).
As amostras bacterianas foram obtidas de um banco de amostras clínicas enviadas para culturas de rotina no Laboratório de Bacteriologia do HUPE e no Laboratório 2 da Disciplina de Microbiologia.
Reativação das amostras e caracterização por provas fenotípicas
- Verificação do metabolismo
- Verificação da motilidade
- Utilização de aminoácidos
- Verificação da atividade da Citocromo-oxidase
Como referência para identificação fenotípica, seguiu-se o recomendado pela Sociedade Americana de Microbiologia na 11ª edição do Manual de Microbiologia Clínica (Tabela 2) (LIPUMA et al., 2015). Tubos com OF-glicose (BD®), com e sem óleo mineral, foram inoculados com agulha bacteriológica, repetida de 3 a 5 vezes até 2/3 da profundidade. Um teste de motilidade (BD®, Heidelberg, Alemanha) e uma solução de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC) a 1% (INLAB, São Paulo, Brasil), na proporção de 1 ml para cada 100 ml de cultura base, foi realizada com semeadura única e central em até 2/3 da profundidade do meio de cultivo e incubada por 24 a 48 horas em condições aeróbias a 35 ±2ºC.
A adição da solução de TTC otimiza a interpretação do teste ao detectar a motilidade, pois as bactérias CBc são capazes de reduzir o TTC e produzir uma cor avermelhada no meio (LEVY et al., 2004). As cepas Escherichia coli ATCC® 25922 e Acinetobacter baumannii ATCC® 19606 foram utilizadas como controles positivo e negativo. Para observação dos ensaios de utilização de aminoácidos foi utilizada base de descarboxilação de Moeller (BD®) mais lisina 1%, arginina 1% e ornitina 1% (BD®), em tubos diferentes, e a mesma base sem adição de aminoácidos. para controle negativo.
O meio de cultura líquido foi inoculado com alça bacteriológica e incubado por 24 a 48 horas em estufa bacteriológica a 35 ± 2ºC, em condições aeróbias. Para realizar um ensaio de atividade da citocromo oxidase a partir de uma cultura pura em meio CAB, um pequeno número de colônias foi transferido através de uma alça bacteriológica para tiras impregnadas com o reagente para indofenol oxidase (N-N-dimetil-p-fenilenodiamina 2,5 g/L, alfa -naftol 2,5 g/L e álcool etílico 500 ml/L) (NEWPROV®, Paraná, Brasil), pré-umedecido com água purificada estéril, esfregou a colônia sobre a tira e observou o desenvolvimento da cor em poucos segundos (15 a 20 segundos) e pode causar reações retardadas ou fracas.
Identificação por espectrometria de massa
Processamento das amostras
Análise dos espectros de massa
Identificação molecular das espécies do CBc pelo sequenciamento do
- Extração do DNA bacteriano por lise térmica
- Quantificação e amplificação do gene recA
- Análise do DNA bacteriano por eletroforese em gel de agarose
- Purificação da amostra
- Sequenciamento do gene recA
- Análise das sequências do gene recA
A partir da amplificação, o resultado foi confirmado por eletroforese em gel de agarose ultrapuro (Invitrogen®, Carlsbad, EUA) a 1,5% em tampão borato de sódio (tampão SB), 1 a 10 mM, pH 8,0, 1X. Após a coagulação, 1X tampão SB foi adicionado e 2 µL de DNA amplificado de cada amostra foram aplicados juntamente com 1 µL de GelRed™. O tamanho das sequências foi estimado por comparação com o padrão de peso molecular de 100 pb (Invitrogen®, Carlsbad, EUA) utilizado na corrida.
Após encontrar a banda correspondente à amplificação do gene recA (1040 pb), a amostra foi submetida à purificação em coluna utilizando um kit de purificação de DNA por centrifugação do Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega®, Madison, WI , EUA). Posteriormente, o fluxo foi descartado e a minicoluna foi reinserida no tubo coletor, foram adicionados 700 µL de solução de lavagem de membrana e centrifugados a 16.000 rpm por 1 minuto. A minicoluna foi transferida para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mL e 50 µL de água ultrapura foram adicionados à minicoluna.
O DNA purificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose, seguindo as mesmas especificações descritas anteriormente. Em seguida, visualizados utilizando um transiluminador de luz ultravioleta e um sistema de captura de imagem digital DigiDoc-It™ Imaging System (UVP®, Califórnia, EUA), para confirmar a pureza, manutenção e qualidade do DNA purificado. Para cada reação, 2 μL de DNA purificado (correspondente a 20 ng) foram adicionados a 8 μL da mistura de PCR (volume de reação de 10 μL), que continha 5 μL de água estéril, 1,5 μL de tampão de sequenciamento 5X, 1 μL de a solução contendo o iniciador (3,2 pmol) e continha 0,5 μL de Big-dye (Applied Biosystems®, Foster City, EUA).
A reação foi realizada em quadruplicata para cada substrato, em Termociclador Veriti® de 96 Poços (Applied Biosystems®, Foster. City, EUA), com desnaturação inicial de 1 minuto a 96ºC, seguido de 35 ciclos de 15 segundos a 96ºC. segundos a 50ºC e 2 minutos a 60ºC. 2,5 μL de EDTA 0,125 M, 30 μL de etanol absoluto, misturado por inversão, deixar 15 min em temperatura ambiente, centrifugar a 4.000 rpm a 4°C por 45 min, descartar o sobrenadante por inversão, centrifugar rapidamente com a placa adicionada invertida 30 μL 70 % de etanol, centrifugado a 4.000 rpm a 4°C por 15 min, descartou o sobrenadante invertendo a placa e invertendo a placa a 4.000 rpm por 1 min. A placa foi novamente colocada em termociclador (95° por 5 min) e imediatamente colocada em gelo por 5 min e injetada no sequenciador Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems®, Foster City, EUA), onde foram obtidos os eletroferogramas conforme as amostras. passado através de capilares contendo polímero de desempenho otimizado (Applied Biosystems®).
Utilizando as sequências obtidas, os contigs (sequências únicas de DNA) foram alinhados no programa Geneious 7.1.5 (Biomatters®, Auckland, Nova Zelândia) e com a sequência de referência para cada espécie de CBc utilizando o programa Mega v.7.0 alinhado. (KUMAR et al., 2016). Regiões homólogas e variáveis entre as sequências obtidas do gene recA de referência e amostras clínicas também foram avaliadas comparativamente entre si por meio do Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), presente na base de dados GenBank® (NCBI, Bethesda, EUA) (Tabela )3).
Características da amostragem
Caracterização fenotípica do CBc
Identificação do CBc por espectrometria de massa
Quanto ao perfil de identificação das amostras provenientes de cultivo no ambiente ASC, as mesmas foram identificadas e oito (18,6%) não apresentaram pontos para identificação. Dezessete (40,5%) amostras provenientes da cultura CAB foram identificadas, mas não apresentavam levedura para identificação e quatro (9,3%) apresentaram pontuação inferior a 1,70 caracterizada como identificação não confiável. Nota: Conforme critérios de interpretação padronizados pela Bruker Daltonics®: pontuação < 1,7 - Identificação não confiável Amostras identificadas; e <0 - Nenhum ponto encontrado.
Com os espectros de massa obtidos, as identificações foram classificadas de acordo com as contagens (log) pelo Módulo FlexControlTMv. 3.3 (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha), que permite avaliar o nível de caracterização e confiança das amostras. Observou-se um aumento de 27,91% no perfil das amostras identificadas em nível de espécie e de 41,86% em nível de gênero, de acordo com os critérios de interpretação (escore) estabelecidos pelo fabricante, em amostras semeadas em meio ASC comparado ao meio CAB ( Gráfico 2).
Quanto ao perfil de identificação das amostras por espécie (Gráfico 3), considerando a semeadura em meio ASC, dezoito (51,42%) amostras foram caracterizadas como B. 3,3 (Bruker Daltonics GmbH®, Leipzig, Alemanha) espectros de massa das amostras e transferido para análise no programa Bionumerics v. 6.6 (Applied Maths®, Sint Marten Letem, Bélgica) que possibilita a criação de árvores (Figuras 5, 6), que demonstram a partir dos valores de similaridade uma inspeção da coerência dos perfis espectrais entre as amostras, pela similaridade coeficiente e método de agrupamento pelo algoritmo Neighbour-joining.
Árvores filogenéticas sem raízes foram construídas a partir de uma matriz de distância e de acordo com o princípio da evolução mínima, assumindo como argumento a aditividade da matriz de distância, onde a eficácia deste método tem demonstrado superioridade sobre outras formas de reconstrução de árvores (SAITOU; NEI , 1987; LI, 2015). Através dos nós formados na árvore filogenética que compartilham um nó interno comum, denominado junção vizinha, foi observada a separação das amostras em termos de identificação das espécies obtidas nos dois meios de cultura utilizados (CAB e ASC), independente da pontuação obtida pelo MALDI -TOF MS. No meio ASC, onde foi obtido o maior número de identificações de amostras, houve segmentação de amostras pertencentes à espécie B.
Com exceção de apenas uma amostra do subtipo IIIA (20313) observada no grupo de amostras do subtipo IIIB. Também podemos observar a proximidade de amostras relacionadas ao mesmo paciente, como visto nas amostras de B.
Identificação das espécies do CBc pelo sequenciamento do gene recA
Comparison of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (maldi-TOF) mass spectrometry platforms for identification of gram-negative rods from patients with cystic fibrosis. Evidence for transmission of Burkholderia cepacia, Burkholderia multivorans and Burkholderia dolosa among persons with cystic fibrosis. Guidelines for the diagnosis of cystic fibrosis in newborns through older adults: Cystic Fibrosis Foundation consensus report.
Rapid identification of Burkholderia cepacia complex species recovered from cystic fibrosis patients using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Flight time. Virulence factor expression patterns and antimicrobial resistance in Achromobacter xylosoxidans and Achromobacter ruhlandii isolates from cystic fibrosis patients. Epidemiol Infect. Identification of Burkholderia and uncommon non-glucose-fermenting Gram-negative bacilli isolated from cystic fibrosis patients using matrix-assisted laser desorption ionization-Time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS).
Stenotrofomonas maltophilia Phenotypic and genotypic diversity during a 10-year colonization in the lungs of a patient with cystic fibrosis. Stenotrofomonas maltophilia in cystic fibrosis: serological response and effect on lung disease.Am J Respir Crit Care Med.
