Geral
Específicos
Linhagens celulares
Cultura de células
Contagem de células
Obtenção do meio condicionado do tecido adiposo
Isolamento e quantificação das micropartículas
Uma amostra controle contendo microesferas de 1 µm (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foi usada para definir adequadamente em um citômetro de fluxo o perfil FSC/SSC contendo MP (eventos <1 µm) e microesferas de 10 µm foram usadas como calibradores para estimar MP /µL contagens.
Ensaio de proliferação (MTT)
Obtenção de extratos totais
Após atingirem a confluência, as células foram tratadas com os seguintes estímulos: MC (20%) ou MPs (20 μg/ml) provenientes da cultura de explantes de TA de indivíduos eutróficos ou obesos, em DMEM suplementado com 10% de FBS, por 24 horas, 37ºC e 5% CO2. No final do tratamento, as células foram lisadas em tampão de lise RIPA (Tris 50 mM; pH 8). A obtenção do extrato total de MPs per se foi realizada pelo isolamento dos MPs a partir de uma quantidade inicial de 1,5 ml de MC do TA de cada paciente separadamente.
O teor de proteína do extrato total foi determinado pelo método BCA (Thermo Scientific, Rockford, EUA) e após a determinação do teor de proteína, 20% do seu volume de tampão de amostra concentrado 5x (Tris-HCl 50) foi adicionado ao extrato total. extrai mM, pH 6,8, SDS 1%, 2-mercaptoetanol 5%, glicerol 10%, azul de bromofenol 0,001%).
Eletroforese e western blotting
A seguir, avaliamos se o tratamento com MC e MP de AT obesos seria capaz de modular a migração de células MCF-7 e MDA-MB-231. Como podemos ver na Figura 18, tanto o MC quanto o MP do TA causaram um aumento na capacidade invasiva das células MDA-MB-231. Nossos resultados mostraram que células HMEC-1 tratadas com o sobrenadante de células MDA-MB-231 (previamente tratadas com MC de TA obeso) formaram um maior número de estruturas (Figura 23 B) e que o tamanho dessas estruturas foi aumentado. (Figura 23 C).
Não observamos tal efeito em células endoteliais tratadas com o sobrenadante de células MDA-MB-231 (previamente tratadas com MPs de TA obeso) (Figuras D e E). Em seguida, as células HMEC-1 foram tratadas com o sobrenadante MDA-MB-231 (contendo MC mais factores segregados pelas próprias células). Nossos resultados mostraram um aumento na capacidade tubulogênica de células HMEC-1 tratadas com o sobrenadante de células MDA-MB-231 (previamente estimuladas com MC de AT obeso).
No entanto, não observamos alteração no perfil fenotípico de células HMEC-1 tratadas com o sobrenadante de células MDA-MB-231 (previamente estimuladas com LPs de AT obeso). Além disso, observamos que as células MDA-MB-231 por si só também carecem dessa capacidade. Como as células MDA-MB-231 se tornaram mais invasivas após a secreção de TA obeso, avaliamos quais MMP poderiam estar envolvidas nesse processo.
De acordo com nossos dados, apenas MPs de TAs espessas foram capazes de induzir a expressão de mRNA de MMP-9 em células MDA-MB-231.
Ensaio de migração por wound healing
Ensaio de invasão celular
Observamos anteriormente que tanto MC quanto MP derivados de TA espessa poderiam induzir um aumento na migração de células MDA-MB-231, então nos perguntamos se o mesmo tratamento também poderia induzir um aumento na invasão. Considerando que a secreção de ATs espessos aumentou a proliferação de células MCF-7 e causou aumento na capacidade migratória e proliferativa de células MDA-MB-231, decidimos investigar quais vias de sinalização modulam tais processos. Como nossos resultados mostraram que MC e MP de TAs espessos poderiam aumentar a migração e invasão de células MDA-MB-231, bem como aumentar a fosforilação de AKT, avaliamos se essa via de sinalização poderia estar envolvida nesses processos.
Além de reduzir a capacidade de migração, a inibição desta via também foi capaz de impedir a invasão de células MDA-MB-231 (Figura 22), através do tratamento com secreção de AT obeso. Nossos resultados mostraram que o tratamento de células HMEC-1 com o sobrenadante de células MDA-MB-231 (previamente estimuladas com MC de TA obeso) apresentou maior capacidade tubulogênica. Como o processo de invasão é dependente de MMPs e que o tratamento do AT obeso poderia induzir a invasão de células MDA-MB-231, avaliamos a participação da MMP-9 nesse processo.
De acordo com a Figura 25, podemos observar que os MPs de TAs espessos causaram um aumento significativo na expressão de mRNA de MMP-9 em células MDA-MB-231, o que poderia explicar o aumento de sua invasividade. Esses estudos de coorte confirmam nossos resultados in vitro com células MDA-MB-231, uma vez que o nocaute do TA espesso foi capaz de aumentar a capacidade migratória e invasiva dessas células.
Tubulogênse
RT-PCR
Em seguida, foram tratados com estímulos MCs (20%) ou MPs (20 µg/mL) provenientes de cultura de explantes de TA de indivíduos eutróficos ou obesos, em DMEM suplementado com 5% de FBS. O RNA total foi extraído pelo método de separação em coluna. As amostras de RNA foram retrotranscritas em DNA complementar usando o kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade (Applies Biosystems), que contém tampão de magnésio contendo H2O, dNTPs, primers aleatórios e enzima transcriptase reversa. Amostras complementares de DNA foram armazenadas em freezer a -20ºC até o uso.
A amplificação da MMP-9 (Qiagen – QT00040040) foi realizada utilizando cDNA na presença da sonda fluorescente SybrGreen® (Qiagen) em reação de PCR. A expressão relativa foi determinada pela análise 2-ΔΔCt, que representa o valor de expressão do gene analisado em relação ao seu calibrador. A condição padrão para a reação de PCR foi: 95 °C por 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 °C por 5 segundos e 60 °C por 10 segundos, seguido por uma curva de desnaturação padrão.
Zimografia
Análises estatísticas
Padronização da concentração de meio condicionado a ser
O meio condicionado e as micropartículas do tecido adiposo
O meio condicionado e as micropartículas do tecido adiposo
O meio condicionado e as micropartículas do tecido adiposo
Sabe-se que as células tumorais apresentam uma desregulação destes sinais e podem adquirir a capacidade de sustentar a sinalização proliferativa, migratória e invasiva através de diferentes vias de sinalização. Em condições normais, a via de sinalização PI3K/AKT contribui para muitos processos, incluindo ciclo celular, crescimento celular, sobrevivência, migração e transporte de vesículas intracelulares (VANHAESEBROECK et al., 2010). Essa via de transdução de sinal é uma das atividades mais comuns no câncer, onde ainda desempenha papel importante no crescimento, proliferação, motilidade e sobrevivência celular, porém em favor das células tumorais (YUAN e CANTLEY, 2008).
A via de transdução de sinal ERK pertence à família MAPK (ROUSE et al, 1994), ambas relacionadas à regulação da progressão do ciclo celular e à apoptose em vários tipos de células. Nossos resultados mostraram que o tratamento com MC e MPs de TA obeso induziu a fosforilação da via de sinalização ERK em células MCF-7 (Figura 19 A) sem alterar a via AKT (resultado não mostrado). Nossos resultados mostraram que MC e MPs derivados de TA obeso induziram aumento na proliferação de células MCF-7, além de induzirem a fosforilação da via de sinalização ERK.
A via de sinalização da AKT tem um papel primordial no aumento
A migração celular foi avaliada utilizando o método de cicatrização de feridas, após 24 horas (em comparação com 0 horas). Portanto, este resultado demonstra a importância da via PI3K/AKT tanto nos processos de migração quanto de invasão. As análises do número de células que migraram foram realizadas utilizando o software Photoshop CS5.
O sobrenadante de células MDA-MB-231, tratadas com o meio
Nossos resultados mostraram que houve aumento significativo na liberação de adipocinas pró-inflamatórias, como TNF-α, leptina e MIP1-α, e também nos níveis de VEGF e IL-10 secretados por AT obesos (RENOVATO-MARTINS et al. al., 2017), confirmando os dados encontrados na literatura. Outros dados do nosso grupo mostraram que MPs liberadas por receptores de transporte AT de obesos, como o TLR8, que desempenham um papel importante na polarização de monócitos humanos para um perfil pró-inflamatório (CD14+CD16+) (RENOVATO-MARTINS et al., 2017 ) ). Embora um estudo de Li e colaboradores tenha mostrado que além de proliferarem por essa via, essas células também são capazes de migrar e invadir ( LI et al., 2017 ), não observamos tal comportamento.
Durante esse crescimento, as células dentro da massa tumoral aumentam sua distância dos vasos, tornando o ambiente do núcleo tumoral hipóxico (SHWEIKI et al., 1992; BROWN et al., 1999). A expressão de VEGF é mediada pelas próprias células tumorais e pode ser potencializada por eventos genéticos comuns que levam à transformação maligna (RAK et al., 2000). Além disso, medeia a secreção e ativação de enzimas envolvidas na degradação da matriz extracelular, como as MMPs, possibilitando o desenvolvimento de novos vasos sanguíneos (UNEMORI et al., 1992).
Portanto, a atividade dessas enzimas é essencial para o início do processo de invasão, o que permite que as células tumorais atravessem a membrana basal epitelial do tecido adjacente e assim invadam o estroma intersticial (AZNAVOORIAN et al., 1993). A comunicação célula a célula é essencial durante o desenvolvimento em muitos fatores fisiológicos e processos patológicos (QUAIL e JOYCE, 2013), que podem ser mediados por vesículas extracelulares (VEs) (COLOMBO et al., 2014; YOON et al., 2014) .
Meio condicionado do tecido adiposo per se não induziu
O tratamento das células MDA-MB-231 com as micropartículas do
As MMPs são enzimas responsáveis por promover a progressão tumoral, aumentando a angiogênese tumoral, perturbando a arquitetura local do tecido e permitindo assim o seu crescimento.
Micropartículas oriundas do tecido adiposo obeso expressam
Em relação ao câncer de mama, evidências claras mostram aumento da incidência desse tipo de câncer em forte relação com IMC elevado (WOLIN et al., 2010), além de pior prognóstico (CALLE e KAAKS, 2004; PROTANI et al., 2010; FORD et al., 2013). Histologicamente, esses macrófagos são encontrados ao redor dos adipócitos formando estruturas em formato de coroa, que nada mais são do que adipócitos em processo de morte celular rodeados por macrófagos (CANCELLO et al., 2005). Sabe-se que a sinalização celular induzida por estrogênio contribui crucialmente para o estabelecimento do câncer de mama associado à obesidade (MORRIS et al., 2011; SUBBARAMAIAH et al., 2011; SUBBARAMAIAH et al., 2012).
A correlação do IMC elevado com o risco de tumores de mama na pós-menopausa responsivos a hormônios já está bem estabelecida (SUZUKI et al., 2009), porém, em relação às células que não respondem a fatores hormonais, conhecidas como triplo negativo, os estudos são mais recentes. . Evidências de estudos observacionais e laboratoriais sugeriram que a obesidade pode contribuir para a progressão de cânceres triplo-negativos através da resistência à insulina, secreção de adipocinas pró-angiogênicas, como a leptina, e inflamação crônica induzida pela AT (PHIPPS et al., 2008). Sabe-se que a angiogênese apoia o processo de invasão (TALMADGE e FIDLER, 2010), além de desempenhar um papel importante no crescimento tumoral, protegendo a neovasculatura da apoptose através da indução de proteínas antiapoptóticas (TRAN et al., 1999; HARMEY e BOUCHIER -HAYES, 2002).
Curiosamente, vimos que as MPs do TA de pacientes obesos não apenas expressam MMP-2 e 9, mas também apresentam atividade proteolítica aumentada, como observamos no teste de zimografia, confirmando dados da literatura que mostram a relação dessas MMPs com a obesidade (BELO et al., 2013; ALLOTT et al., 2013; LEE et al., 2014). Assim como vimos em nossos resultados vários estudos têm demonstrado o papel primordial dos EVs no câncer, capazes de transferir proteínas oncogênicas e ácidos nucléicos que modulam as células alvo e desempenham um papel decisivo na tumorigênese, crescimento, progressão, resistência a drogas e metástase (FRIEDL e WOLF, 2003; BIGAGLI et al., 2016; HOOD, 2016; KIM et al., 2016; WANG et al., 2016; LI et al., 2016).
