Crescimento de Bacillus subtilis (UFC/mL) em diferentes meios de cultivo à base de escamas de peixe e caldo nutritivo 43. Curva de crescimento de Bacillus subtilis em meio de cultivo utilizando hidrolisado protéico de escamas de peixe (C2 Broth) 44.
Objetivo geral
Objetivos específicos
Produção de pescado no Brasil
Geração e aproveitamento de resíduos
Escamas de peixe
Embora a queratina seja recalcitrante e resistente à ação proteolítica, essa proteína sofre decomposição na natureza, demonstrando a existência de microrganismos queratinolíticos capazes de quebrar a queratina e utilizá-la como fonte de energia. Os microrganismos queratinolíticos são assim denominados devido à produção de queratinases, ou seja, enzimas que podem quebrar substratos de queratina de forma mais eficiente do que outras enzimas proteolíticas (OLIVEIRA, 2006).
Gênero Bacillus
Microrganismos queratinolíticos, tanto mesófilos quanto termofílicos, podem ser encontrados em vários ambientes, independentemente do histórico de deposição de materiais queratinosos, em ambientes aeróbicos ou anaeróbicos. Assim, a produção de queratinase na natureza parece ser comum, indicando o papel dos microrganismos queratinolíticos na ciclagem de componentes das moléculas de queratina como carbono, nitrogênio e enxofre. Dentre eles, o gênero Bacillus possui a maior representatividade, com várias espécies descritas com potencial queratinolítico como B.
Por outro lado, microrganismos Gram-negativos com potencial queratinolítico são menos abundantes que os Gram-positivos, com alguns gêneros descritos como Aeromonas sp., Vibrio sp., Serratia spp., Paracoccus spp. Vários microrganismos do gênero Bacillus podem utilizar fontes complexas de carbono como polissacarídeos, ácidos nucléicos, lipídios e polímeros complexos por meio da produção de enzimas hidrolíticas extracelulares que clivam esses compostos (MADIGAN et al., 2016).
Meio de crescimento microbiano
Enzimas microbianas
Aproveitamento de resíduos de tilápia (Oreochromis niloticus) para o desenvolvimento de novos produtos de valor agregado. Avaliação do potencial biotecnológico de bactérias do gênero Bacillus na degradação de resíduos de pele suína na indústria de alimentos. Caracterização de escamas de piau (Leporinus elongatus) e sua aplicação na remoção de Cu(II) de meios aquosos.
O presente estudo teve como objetivo investigar o potencial biotecnológico de bactérias do gênero Bacillus na degradação de escamas de peixes. Acredita-se que para cada quilo de peixe, aproximadamente 6% correspondam a restos de escamas (BASU; BANIK, 2005). Os resíduos de escamas também são encaminhados para produção artesanal e compostagem, onde se decompõem pouco.
A dificuldade em tratar o resíduo de cal é atribuída à rigidez da queratina, proteína fibrosa presente na composição. Existem vários microrganismos queratinolíticos que produzem queratinases para a quebra da queratina, sendo a maioria bactérias Gram-positivas do gênero Bacillus. Com base nisso, o presente estudo teve como objetivo investigar o potencial biotecnológico de bactérias do gênero Bacillus na quebra de escamas de peixes.
Material e Métodos
As queratinases são proteases específicas de origem intra ou extracelular que diferem das demais proteases por possuírem maior capacidade de degradação em substratos compactados (TORK et al., 2013). O crescimento foi então testado em meio de ágar em escala triturada (1 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 1 g de NaCl, 5 g de escala e 15 g de ágar, pH 6,5). Das colônias que cresceram no meio, cinco foram selecionadas para posterior teste de atividade proteolítica (SILVA et al., 2010).
Dos isolados que cresceram no meio de cultura, cinco foram testados para degradação de escamas de peixe (TEBALDI et al., 2008). Os isolados bacterianos que apresentaram atividade proteolítica foram ativados em ágar TSA inclinado e incubados a 37 ºC por 24 horas. O pH do meio de cultura foi primeiro ajustado (antes da inoculação com o microrganismo) para 6,2 e verificado após 6 dias de decomposição.
WEISBURG et al., 1991) para o domínio Bacteria, utilizando os seguintes reagentes e concentrações: 60 ng de DNA de cada amostra; 1x Tampão de Enzima Taq DNA Polimerase; MgCl2 3,7mM; 0,6 pmol/µL dNTPs; 0,4 pmol/µL de cada primer; 5 U Taq DNA polimerase, com volume final ajustado para 50 µL com água ultrapura. Posteriormente, os amplicons foram purificados utilizando o kit Illustra® GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences) para posterior identificação de nucleotídeos utilizando o sequenciador automático ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) da empresa ACTGene Análises Moleculares LTDA. O programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1990) foi utilizado para comparar as sequências de cada isolado com aquelas depositadas em bancos de dados públicos incluídos nas análises para comparação.
Resultados
A taxa de degradação do isolado B2 diferiu estatisticamente das taxas dos demais isolados no teste de degradação em escala de solo (Tabela 2). Taxa média de rendimento da degradação de escamas de tilápia por bactérias do gênero Bacillus. Valores seguidos da mesma letra minúscula em cada coluna e da mesma letra maiúscula seguida não diferem estatisticamente, segundo o teste de Scott-Knott (p≤0,05).
Os resultados das médias de pH encontradas no meio utilizado para a degradação das escamas de tilápia após seis dias de degradação são apresentados na Tabela 3. Observou-se que a variação de pH foi a mesma para os isolados B2 e B3 em relação aos testes de degradação com matéria-prima escamas e escamas trituradas. O isolado B1, que apresentou a melhor taxa de degradação da escama triturada, foi identificado na análise molecular como Bacillus subtilis (Tabela 4).
O isolado B4 também se destacou na degradação de incrustações de solo, especialmente na degradação de incrustações brutas. Embora o valor de pH do meio onde o isolado B4 tenha diminuído em ambos os testes, o isolado B4 apresentou a melhor taxa de degradação da incrustação bruta. 1 Os amplicons foram sequenciados em ambas as orientações (F-forward) e (R-reverse) e os fragmentos de consulta mostrados correspondem à sequência contig obtida.
Discussão
P45 em caldo de penas produziu protease extracelular e queratinase que atingiram atividade máxima em dois dias de cultivo e declinaram a partir de então. Para cepas de Bacillus, o tempo médio necessário para o microrganismo crescer e produzir queratinases costuma variar entre 24 e 168 horas (MOUSAVI et al., 2013; TORK et al., 2013). O tempo de cultivo varia de acordo com o tipo de substrato queratinoso e sua concentração (BALAJI et al., 2008; KUMAR et al. Uma opção que pode aumentar a produção da enzima seria aumentar o período de incubação durante a fase estacionária.
A adição de suplementos dietéticos, como glicose e extrato de levedura, pode induzir supressão catabólica (MADIGAN et al., 2016). Para Adiguzel et al. 2009) o uso de suplementos alimentares é opcional e depende do metabolismo de cada microrganismo, que pode estimular ou inibir a secreção de proteases. O valor do pH do meio contendo os isolados B2, B3 pode ter diminuído devido à produção de metabólitos, que podem ter reduzido ou inibido a atividade enzimática e consequentemente a degradação das escamas dos peixes (MADIGAN et al., 2016).
A tendência de aumento do pH no meio de cultura é resultado da produção de amônia pela desaminação de aminoácidos e peptídeos derivados da degradação da queratina. Microrganismos crescendo em substratos protéicos normalmente causam um aumento do pH no meio de cultura (KUMAR et al., 2008). Muitos estudos têm relatado processos de degradação, principalmente com referência a substratos queratinosos como pelos, penas e farinha de penas e caracterização de enzimas (MANCZINGER et al., 2003; RIFFEL; BRANDELLI, 2006), demonstrando a crescente necessidade do desenvolvimento de processos que garantir o aproveitamento integral dos resíduos para redução de custos e redução do impacto ambiental.
Conclusões
Quanto maior a capacidade queratinolítica dos microrganismos, mais alcalino se torna o meio de cultura (DAROIT; CORRÊA; BRANDELLI, 2009).
AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE MEIOS FORMULADOS A PARTIR DE ESCAMAS DE PEIXE UTILIZANDO A CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE BACILLUS. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE MEIOS FORMULADOS A PARTIR DE ESCALA DE PEIXES NA CINÉTICA DE CRESCIMENTO DE BACILLUS SUBTILIS Jéssica Ferreira MAFRA, Thiago Alves Santos de OLIVEIRA, Norma Suely EVAGELISTA-. Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de diferentes formulações de meio de cultura à base de escamas de peixe para o crescimento de Bacillus subtilis.
The efficiency of the formulated methods was presented by the specific speed of growth μ (h-1) and the rate of duplication, td (h) of Bacillus subtilis. In this sense, the present study aimed to evaluate the effectiveness of different formulations of culture medium based on fish scales for the growth of Bacillus subtilis. The effectiveness of the formulated media was presented by the specific growth rate μ (h-1) and the generation time, tg (h) of Bacillus subtilis.
Bacillus subtilis é uma espécie GRAS (geralmente reconhecida como segura) que produz e secreta várias proteínas e tem uma alta taxa de crescimento. Os laboratórios de pesquisa e/ou clínica comumente utilizam diferentes meios de cultura para atender às necessidades nutricionais das células microbianas, mas os gastos com meios de cultura podem sobrecarregar as operações do laboratório (MADIGAN et al., 2016). Com base nisso, o presente trabalho teve como objetivo estudar diferentes formulações de meio de cultura à base de escamas de peixe para substituir a formulação de meios de cultura comerciais para o crescimento de Bacillus subtilis.
Material e métodos
Caldo C2: hidrolisado de casca da degradação prévia de 1 g de escamas moídas por Bacillus subtilis B1. A cinética de crescimento do microrganismo (Bacillus subtilis) foi utilizada para verificar a eficiência dos meios de cultura experimentais (caldos C1 e C2) em relação ao meio controle (caldo nutriente). A utilização de escamas de peixe na formulação de um meio de cultura é possível, dada a sua eficiência no desenvolvimento microbiano de Bacillus subtilis em relação ao meio de cultura comercial (caldo nutriente).
A Figura 1 mostra as curvas de crescimento obtidas para o cultivo de Bacillus subtilis nos três meios testados (caldo C1, caldo C2 e caldo nutriente). Curvas de crescimento associadas ao cultivo de Bacillus subtilis em caldo de escamas de peixe (C1), caldo hidrolisado de proteína de escamas de peixe (C2) e caldo nutritivo comercial. A duração da fase exponencial de Bacillus subtilis na pasta C1 foi de 3 a 12 h, sendo esta a fase mais curta entre os meios testados, com taxa de crescimento específica de 0,839 h-1 e tempo de geração de 49,56 min.
Curva de crescimento de Bacillus subtilis em meio de cultura utilizando proteína hidrolisada de escama de peixe (C2 slurry). A Tabela 2 resume os resultados encontrados para a taxa de crescimento específica, sua análise de variância, o tempo de geração e a duração da fase exponencial em cada um dos meios testados relacionados ao crescimento microbiano de Bacillus subtilis. Taxa de crescimento específica (µ), tempo de geração (td) e duração da fase exponencial da cultura de Bacillus subtilis em três meios diferentes.
No crescimento de Bacillus subtilis no caldo de escamas de peixe (caldo C1) houve uma diminuição imediata na taxa de crescimento após a fase exponencial, na transição para a fase estacionária. Concluiu-se que o caldo C1 foi o mais eficiente para o crescimento de Bacillus subtilis e que a utilização de escamas na composição do meio de cultura para o cultivo de Bacillus subtilis é viável uma vez que o crescimento em caldo de escamas se mostrou mais eficiente. .
