Glioblastoma multiforme is the most common and aggressive adult primary tumor of the central nervous system. The stress in the RE activates a response of the unfolded protein (UPR), responsible for the maintenance of the functional proteome, and this response activates three main axes to deal with RE stress.
CÂNCER
GLIOBLASTOMA MULTIFORME
TEMOZOLAMIDA
TMZ é um agente alquilante que danifica as bases do DNA e apresenta caráter tóxico e mutagênico (ZHANG; F.G. STEVENS; D. BRADSHAW, 2012). Ao comparar a alquilação de N7-meG e O6-meG, o segundo tipo de lesão é notavelmente mais citotóxico, pois pode parear inadequadamente com a timina durante a replicação celular e causar sua parada (FU; CALVO; SAMSON, 2012).
MECANISMO DE REPARO
Mecanismo de Reparo e Resistência a Temozolamida
Entre as principais vias de reparo envolvidas na citotoxicidade da TMZ, a via de reparo de reversão direta com a enzima metilguanina-DNA metiltransferase (MGMT) que remove o aduto O6-MeG da guanina, a via de reparo de incompatibilidade (reparo de incompatibilidade MMR) e a excisão de base de DNA via de reparo (BER ) que remove os N7-MeG e N3-MeA quantitativamente mais abundantes (ZHANG; F.G. STEVENS; D. BRADSHAW, 2012). Portanto, os principais sistemas de reparo de DNA que afetam a citotoxicidade da TMZ são MGMT (reparo direto), MMR e BER (ZHANG; F.G. STEVENS; D. BRADSHAW, 2012).
Reparo por excisão de base de DNA (BER)
Na longa via de reparo, o segmento de DNA é reparado pela DNA polimerase β, δ ou ε e pela DNA ligase I (Fig. 2) (SLUPPHAUG; os locais AP não modificados levam a uma via de reparo pela pol β que gera novos nucleotídeos .se liga e a ligação é então realizada.
ALQUILADENINA DNA GLICOSILASE
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
O RE, que é uma organela multifuncional que acumula diversas funções, desde modular a correta estrutura das proteínas, promover a síntese de lipídios e esteróis e manter o cálcio intracelular, também depende de distúrbios na homeostase celular (ALMANZA et al., 2018). A ocorrência de determinado estresse pode causar alterações na estrutura de proteínas nascentes, levando ao acúmulo de proteínas mal dobradas no RE, o que levará à ativação de uma cascata de sinalização celular em resposta ao estresse com o objetivo de manter a homeostase celular para recuperar. é chamada de resposta protéica desdobrada (UPR) (CHAUDHARI et al., 2014).
RESPOSTA DE PROTEÍNAS DESENOVELADAS (UPR)
- Sinalização por IRE1α
- Sinalização por PERK
- Sinalização por ATF6
- Estresse no Retículo Endoplasmático e Câncer
O CHOP tem ação relacionada à apoptose, enviando a célula à morte celular programada em caso de níveis de estresse irreversíveis no RE. Estes incluem GADD34, feedback para inibir PERK, e CHOP, que pode induzir apoptose em células com níveis irreversíveis de estresse de RE.
INDUTORES DE ESTRESSE NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO
Salinomicina
O papel do SLN na indução da autofagia é discutido por Li (LI et al., 2013), que mostra que células humanas NscLc (câncer de pulmão de células não pequenas) tratadas com SLN, além de induzirem o processo de autofagia, também induziram estresse no RE . Em estudo de Jangamreddy (JANGAMREDDY et al., 2009), também foi demonstrado o envolvimento do SLN na indução da autofagia.
AUTOFAGIA
Atg6 funciona na via de sinalização ou inicia a formação de autofagossomas, cujo homólogo de mamífero é Beclin 1. Atg8 (LC3 em mamíferos) também auxilia na formação de autofagossomos, possivelmente aumentando a fusão da membrana e está presente na estrutura.
ARTIGO CIENTÍFICO
A enzima alquiladenina DNA glicosilase (AAG) desempenha um papel importante no desenvolvimento de um mecanismo de resistência ao tratamento do glioblastoma multiforme com Temozolamida (TMZ). AAG é uma glicosilase que inicia o reparo por excisão de bases (BER) induzido pelo agente alquilante TMZ, gerando lesões no DNA como 3meA e 7meG. A indução de estresse no retículo endoplasmático é mediada principalmente pelo acúmulo de proteínas desdobradas e tem sido relatada como estratégia na terapia antitumoral.
O estresse do ER ativa a resposta proteica desdobrada da UPR, que ativa vários eixos, como IRE1α, ATF6 e PERK. Neste trabalho, procuramos avaliar se drogas indutoras de estresse de RE foram capazes de alterar a sobrevivência e viabilidade celular quando combinadas com TMZ em células de glioblastoma (GBM) com diferentes níveis de AAG. A AAG também parece desempenhar um papel importante no desencadeamento da UPR, mostrando que o nível de sua atividade pode modular diferentes eixos da UPR.
Esses achados indicam o envolvimento do AAG na ativação da UPR, além de sugerir que a combinação de TMZ com drogas indutoras de estresse de RE pode ser utilizada como estratégia terapêutica alternativa para GBM. Palavras-chave: Alquiladenina DNA glicosilase, Salinomicina, Temozolamida, Reparo por excisão de base (BER), Resposta proteica desdobrada (UPR).
Introdução
Em geral, a função da UPR é manter a proteostase através de uma resposta altamente regulada que leva a uma redução na síntese protéica e a um aumento na capacidade de dobramento do RE [10]. Tal resposta pode ser adaptativa, promovendo a sobrevivência celular sob estresse moderado do RE ou sob estresse severo que pode levar à morte celular [11]. Por ser um agente ionofórico, o SLN induz estresse no RE e, dependendo do tipo celular examinado, pode induzir autofagia, necrose ou apoptose [7].
Em conjunto com TMZ, este agente indutor de estresse de ER também foi capaz de aumentar a citotoxicidade observada em células GBM [7]. Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que AAG pode estar envolvido na ativação de UPR frente ao tratamento de alquilação [14], daí este trabalho, que tentou avaliar se a modulação de AAG em células GBM afetará o aumento do efeito antitumoral atividade da TMZ por combinação com o indutor de estresse no ER SLN. Nossos resultados mostraram que a citotoxicidade induzida por SLN combinada com TMZ ocorre através da ativação de UPR de maneira dependente de AAG em células GBM.
Além disso, em células que expressam AAG, este tratamento combinado leva à morte celular e prejudica o fluxo autofágico. Portanto, uma melhor compreensão de como diferentes níveis de AAG afetam a resposta ao estresse do retículo endoplasmático e as respostas celulares pode promover avanços no diagnóstico, prognóstico e melhorar o tratamento de pacientes com GBM.
Materiais e Métodos
As análises na Figura 4 mostram que BiP (Figura 4A) representa níveis aumentados de expressão para a linhagem competente para AAG. Os níveis de expressão de mRNA de BiP, CHOP e XBP1A foram quantificados usando qPCR. Estes dados, combinados com os níveis de expressão de ARNm de CHOP, indicam que a activação deste eixo ocorre quando as células são tratadas com um agente alquilante e indutor de stress ER.
A Figura 5C mostra que há uma redução nos níveis de CNX em células proficientes em AAG (shNS) quando tratadas com o agente indutor de estresse de ER, SLN, isoladamente ou em combinação com TMZ. No entanto, o SLN sozinho ou em combinação com o tratamento com TMZ teve menos efeito nos níveis de LC3-II em células deficientes em AAG (DMSO = 0,5 vezes, SLN = 0,9 vezes, SLN + TMZ = 1 vez, Figs. 6B e C) . O tratamento apenas com SLN ou em combinação com TMZ não parece afetar os níveis de p62.
Este tratamento aumentou os níveis de LC3 II, mas não foi eficaz na redução dos níveis de p62 em linhas proficientes em AAG. Expressão de LC3 e p62 em células de glioblastoma após tratamento e co-tratamento com um alquilador (TMZ) e um indutor de estresse de RE. A) Imagem representativa do imunotransferência na análise dos níveis de LC3 e p62 em células T98G sh AAG ou T98G sh NS.
Discussão
Na presença de TP, as células GBM proficientes e deficientes em AAG não responderam diferentemente como observado para o tratamento com SLN, sugerindo que a ação do TP não depende dos níveis de AGG para agir. A avaliação dos níveis de BiP mostrou que existe uma expressão mais elevada de ARNm de BiP na linha celular proficiente em AAG do que na linha celular deficiente em AAG após SLN, TMZ e co-tratamento. A medição dos níveis de expressão de mRNA de XBP1 mostra um aumento para o co-tratamento com TMZ e SLN em células proficientes em AAG.
Os níveis de CHOP e PERK mostram concordância de que o eixo PERK é ativado após a indução do estresse de ER por um agente alquilante associado a um agente indutor de estresse de ER em uma cepa proficiente em AAG. Outra avaliação da UPR foram os níveis de CNX, um acompanhante que garante que apenas proteínas corretamente dobradas saiam do RE [32], foi observada uma diminuição deste acompanhante no tratamento do SLN e também em associação com TMZ em células com AAG funcional . No entanto, o processo parece sofrer alguma interferência à medida que os níveis de p62 aumentam, o que sugere que o fluxo autofágico é prejudicado à medida que os autofagossomos são formados, mas o p62 não é degradado.
Caracterização da expressão e atividade de AAG em células de glioblastoma projetadas para expressar diferentes níveis de AAG. A sensibilidade conferida pelo tratamento com agentes indutores de estresse do RE combinados ou não com TMZ depende dos níveis de AAG.
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