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Regulation of developmental hypertrophy in mouse heart
Doctoral Thesis Author(s):
Leu, Martin Publication date:
2001
Permanent link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-004172294 Rights / license:
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DISS. ETH-No. 14211
Regulation of developmental hypertrophy in mouse heart
A dissertation submitted to THE SWISS FEDERAL INSTITUTE
OF TECHNOLOGY, ZURICH
for the degree of Doctor ofNatural Science
presented by Martin Leu Dip!. Natw. ETH
born 17.08.1971 from Kriens LU
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Jean-Claude Perriard, examiner Prof. Dr. Hans M. Eppenberger, co-examiner
Prof. Dr. Marcus C. Schaub, co-examiner
Zürich, 2001
DEVELOPMENTALHYPERTROPHY
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassung
Hypertrophie des Herzens ist die häufigste Form von Herzerkrankungen, die Herzversagen verursachen kann. Genetische Mutationen in den kontraktilen Proteinen des Sarkomers können dazu führen, dass sich eine krankhaften Hypertrophie entwickelt.
Hypertrophie ist definiert als die Phase des Herzwachstums, die bedingt ist durch die Volumenvergrösserung jeder einzelnen Zelle im Gegensatz zum hyperplastischen Wachstum, das durch die Teilung von Herzzellen verursacht wird.
Wenig ist bekannt über das normale Wachstum der Herzellen nach der Geburt (sogenannte Entwicklungs-Hypertrophie). Möglicherweise sind ähnliche Mechanismen in den Prozess der Entwicklungs- und krankhaften Hypertrophie involviert und das wiederum lässt vermuten, dass neu exprimierte oder hochregulierte Moleküle während der normalen Herzentwicklung auch möglicherweise in der krankhaften Phase eine wichtige Rolle spielen.
Auf den Untersuchungen an den Wachstumsparametem von frisch isolierten Mäuse- Herzzellen nach der Geburt basierend, mit besonderem Bezug auf die Volumenmessung, erschien es vielversprechend mit Hilfe der RDA (representational difference analysis) Methode die mRNA des nachgeburtliehen Tages 0 (PO) mit der von P5 zu vergleichen, dem Zeitpunkt an dem das exponentielle hypertrophe Wachstum beginnt.
Ungefähr 200 Klone wurden nach der Anwendung der RDA Methode analysiert und von denen schienen mehr als 100 während dieser Phase hochreguliert zu sein. 57 Klone besassen einen Insert mit bekannter und 46 mit einer unbekannten Sequenz. Unter den bekannten Sequenzen waren Gene wie zum Beispiel MEK4 und Stat5a, die schon mit dem Prozess der krankhaften Hypertrophie in Verbindung gebracht wurden. Die identifizierten Hypertrophie-verwandten Moleküle lassen vermuten, dass während der Entwicklung nach der Geburt die JNK-Signalkaskade aktiv ist.
Die kompletten Sequenzen von drei unbekannten Proteinen wurden kloniert und resultierten in Proteinlängen von 458 (Protein E5.1), 637 (Protein D4.1) und 896 (Protein H5.1) Amminosäuren. Strukturvorhersagen zeigten für Protein D4.1 ein Zinkfinger Motiv, eine Coil Domäne und eine unbekannte PFAM-Familie-Homologie
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DEVELOPMENTAL HYPERTROPHY Zusammenfassung
und für Protein E5.1 entweder sieben oder acht Transmembrandomänen. Für Protein H5.1 wurden jedoch nur schwache Vorhersagen erhalten. Für alle unbekannten Proteine sind seit kurzem homologe menschliche Sequenzen verfügbar.
Die epitop-markierten Proteine wurden in kultivierten Zellen (COS und NRC) exprimiert und zeigen eine vorherrschende Kern- oder Zytoplasma- (ohne den Kernbereich) Lokalisation für D4.1 und ein gepunktete Färbung über die ganze Zelle für E5.I. Protein H5.1 war fast nicht detektierbar. Einen Hypertrophie-induzierenden Effekt dieser Proteine wie z.B. Volumenzunahme wurde nicht beobachtet.
Northern-Blots zeigten für alle Proteine eine Zunahme der Expression von PO zu P5, aber keines hatte ein auf das Herz beschränktes Expressionsmuster. Analysen von Tiermodellen mit Herzerkrankungen zeigten für D4.1, E5.1 and H5.1 eine Zunahme des mRNA Levels um ungefähr 25% im 'ein Klip eine Niere' Ratten Modell mit Hypertension-induzierter Hypertrophie. Die RNA Level schienen in den GC-A und MLP knock-out Modellen nicht betroffen zu sein, mit der Ausnahme von E5.1, das eine Abnahme von 40% im MLP-/- Tier zeigte.
Die vorhergesagte exklusive Transmembran-Topologie von Protein E5.1 lässt vermuten, dass es, integriert in eine Membran, möglicherweise eine Funktion als Rezeptor-, Kanal- oder Transporter-Protein haben kann. Das vermutete Kern-Zytoplasma Pendeln von D4.1 und die Vorhersagen über eine mögliche DNA-Protein bzw. Protein-Protein Interaktion legen die Vermutung nahe, dass dieses Protein in Transkription und deren Regulation involviert sein könnte. Weitere Studien werden mehr Licht in ihre Funktion und den Bezug zur Hypertrophie bringen.
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DEVELOPMENTAL HYPERTROPHY
SUMMARY
Summary
Cardiae hypertrophy is the most eommon form ofheart disease and ean progress to heart failure. Genetie mutations in eontraetile proteins of the sareomere ean lead to pathologieal hypertrophy. Hypertrophy is defined as the phase of heart growth due to individual eell volume inerease, in eontrast to the hyperplastie growth, whieh is eaused by proliferation of eardiomyoeytes.
Little is known about normal postnatal eardiomyoeyte growth (developmental hypertrophy). Similar pathways may be involved in the proeess of developmental and pathologieal hypertrophy, whieh implement that newly expressed or upregulated moleeules during normal heart development might play an important role in the pathologieal phase.
Based on the investigations of the growth parameters of freshly isolated mouse eardiomyoeytes after birth, espeeially with respeet to the volume measurements, it appeared promising to eompare the mRNA from postnatal day 0 (PO) with postnatal day 5 (P5), were the exponential phase of the hypertrophie growth starts using the RDA (representational differenee analysis) method.
About 200 clones were analysed after the RDA and more than 100 out of them seemed to be upregulated during this phase. 57 clones earried an insert of known and 46 of unknown sequenees. Among the known sequenees there are genes for e.g. MEK4 and Stat5a, whieh have already been implieated in the proeess of pathologieal hypertrophy.
The identified hypertrophy related moleeules suggest an aetivation of the JNK signaling easeade during postnatal development.
Full length sequenees of three unknown proteins were generated with a resulting protein length of 458 (protein E5.1), 637 (protein D4.1) and 896 (protein H5.1) amino aeids, respeetively. Strueture predietions revealed for protein D4.1 a zine finger motif, a eoil domain and an unknown PFAM family homology and for E5.1 seven or eight transmembrane domains. However, for protein H5.1 only weak predietions were retrieved. Reeently submitted human sequenee homologues are available for all unknown proteins.
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DEVELOPMENTALHYPERTROPHY Summary
The epitope tagged proteins were expressed in cultured cells (COS and NRC) showing a predominant nuclear or cytoplasmic (excluding the nuclear area) localisation for D4.1 and a spotty staining throughout the cell for E5.1. Protein H5.1 was almost not detectable. A hypertrophy inducing effect ofthese proteins like e.g. volume increase was not observed.
Northern blots showed for all proteins an increase in expression from PO to P5, but none of them displayed a cardiac restricted expression pattern. Analyses of cardiomyopathy animal models revealed for D4.l, E5.l and H5.1 an increase in mRNA level in the heart of about 25% in the one clip one kidney rat model for hypertension-induced hypertrophy.
The RNA level seemed not to be affected in the GC-A and MLP knock-out models, with the exception of E5.1 displaying a reduction of about 40% in the MLP-/- animal.
The predicted exclusive transmembrane topology of protein E5.1 suggests that it may function as a receptor-, channel- or transporter-protein integrated into a membrane. The assumed nuclear-cytoplasmic shuttling of D4.1 and the predicted structures responsible for DNA-/protein-protein interaction suggests that this protein could be a member ofthe large family involved in transcription and its regulation. Further analyses will elucidate their function and relation to hypertrophy.
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