Pro pokus byl použit OxytocinTM Ferring v koncentraci 5 IU/ml, což odpovídá hodnotě 8,5 μg v 1 ml. Pro nazální podání byl použit aplikátor LMA MAD NasalTM (Teleflex), který vytváří aerosol o velikosti částic 30-100 µm. Intramuskulární podání (i. m.) bylo provedeno pomocí injekcí do semitendinózního svalu (králíci) nebo do deltového svalu (makaci). Dávka byla 5 IU (8,5 μg) ve všech skupinách, tj. průměrně 2,5 μg/kg (1,5 IU/kg) u králíků a 2,1 μg/kg (1,2 IU/kg) u makaků. Zvířata byla rozdělena náhodně do dvou skupin - skupina IN – intranazální a kontrolní skupina IM – intramuskulární. Zvířatům v obou skupinách bylo aplikováno 5 UI oxytocinu, a to ve skupině IN intranazálně a IM intramuskulárně.
Oxytocin byl králíkům podáván po 15 minutách aklimatizace na laboratorní prostředí. Ztráta polohového reflexu byla použita jako měřítko nástupu účinku - sedace. Ten byl definován jako neschopnost králíka se po položení na záda do 30 s sám napřímit. Ztráta reflexu se testovala po 15 s až do jejího nástupu. Krevní tlak (TK) a tepová frekvence TF se měřily oscilometricky na hrudní končetině (přístroj Memoprint S+B MedVet, Babenhausen, Německo). Snímač pulzního oxymetru (Nonin 80500 V, Plymouth, Minnesota, USA) byl umístěn na kůži na vyholené kůži dorzální strany krku pro měření SpO2 a TF. Základní hodnoty byly zaznamenány před podáním léku a poté v pravidelných intervalech: SpO2 a TF po 1 minutě a TK po 5 minutách.
Vzhledem k přirozeně agresivnímu chování opic makak rhesus byl oxytocin podáván buď nazálně dávkovačem LMA MAD nebo injekcí do svalu až poté, co bylo zvíře dočasně znehybněno mechanickým zařízením, které bylo součástí klece. Po podání léku byly u opic pečlivě sledovány změny chování, tj. sedace, ataxie, taktilní reakce, ztráta agresivity (reakce zvířete na blížící se ruku nebo dotyk) a reakce na zvukový podnět (tlesknutí rukou). Agresivní chování zvířat bylo klasifikováno takto: 0 - nesedí, aktivně pozoruje své okolí a snaží se osvobodit; 1 - uspané, klidné, částečná ztráta agresivity po mírném dotyku zkoušejícího; 2 - silně uspané, klidně ležící, úplná ztráta agresivity, zavřené oči. Nezbytná fixace byla použita pouze z bezpečnostních důvodů. (Obr. 21 a 22).
52
Obr. 21. stupeň sedace 1 – zvíře je uspané, klidné, částečná ztráta agresivity po mírném dotyku, z archivu autorky
Obr. 22. stupeň sedace 2 – zvíře silně uspané, klidně ležící, úplná ztráta agresivity, z archivu autorky
53
Jakmile jsme byli schopni umístit monitorovací zařízení na zvířata, začali jsme měřit krevní tlak, tepovou frekvenci a hladinu kyslíku saturace hemoglobinu (SpO2). Krevní tlak a srdeční frekvence byly měřeny oscilometricky hrudní přední končetině opice (Memoprint S+B MedVet), snímač pulzního oxymetru (Nonin 80500 V) byl umístěn na prst přední končetiny, aby bylo možné měřit SpO2 a srdeční frekvenci. Tato měření byla prováděna každých 5 minut po dobu 20 minut.
Statistická analýza byla provedena na Oddělení biostatistiky IKEM. Kardiorespirační parametry byly hodnoceny oboustranným ANOVA testem s opakovanými měřeními s jedním faktorem označeným jako "léčba" (intranazální vs. intramuskulární) a druhým faktorem označeným "čas po podání" s post-hoc Tukeyho t-testem. Doba do ztráty správné polohy reflexu byla vyhodnocena pomocí Studentova t-testu. Všechny statistické testy používaly dvouvýběrové kritérium, přičemž hladinou významnosti p<0,05. U testů ANOVA je uváděn F poměr (rozptyl skupinových průměrů/průměr v rámci skupiny) s odpovídajícími stupni volnosti.
Výsledky
Králíci
Ztráta polohového reflexu
Intranazální podání oxytocinu vedlo ke ztrátě polohového reflexu u šesti pokusných králíků, zatímco ve skupině IM došlo ke ztrátě polohového reflexu pouze u dvou králíků, kterým byl oxytoxin podán intramuskulárně. Průměrná doba do ztráty polohového reflexu byla u těch králíků, kde ke ztrátě reflexu došlo, po podání oxytocinu intranazálně 225±107 sekund a po podání oxytocinu intramuskulárně 420±60 sekund. Délka trvání účinku v minutách (±SD) byla 15,3 (±2,6), resp. 15,5 (±5) po intranazálním a intramuskulárním podání v uvedeném pořadí.
Údaje nebyly statisticky vyhodnoceny.
Tepová frekvence
Statistická analýza (ANOVA, s následným Tukeyho t-testem) prokázala signifikantní vliv oxytocinu (F1,419=5,069, p=0,037), času po podání (F20,419=4,553, p<0,001) a interakci mezi dvěma faktory léčba × čas (F20,419=2,415, p<0,001) na tepovou frekvenci (Graf. 6A). Obecně lze říci, že intranazální podání oxytocinu významně snížilo TF v porovnání s intramuskulárním
54
podáním (p=0,037) se statisticky významnými rozdíly mezi těmito dvěma typy podání po 1-7 min. (Graf. 6A).
Arteriální saturace hemoglobinu kyslíkem
Dvoucestná opakovaná ANOVA neprokázala žádný významný efekt mezi oběma typy léčby na SpO2 F1,419=0,0894, p=0,768, Graf 7A).
Střední arteriální krevní tlak
Dvoucestná opakovaná ANOVA neprokázala významný vliv mezi oběma typy léčby na systolický střední arteriální krevní tlak (F1,119=0,0912, p=0,766, Graf. 8A).
Makakové
Ztráta agresivního chování
Intranazální podání oxytocinu vedlo k rychlému nástupu sedace u většiny ze sledovaných zvířat. U každého zvířete se brzy objevily příznaky sedace (zúžení očí, pokles hlavy, snížení svalového tonu) během několika minut po podání. Sedm zvířat vykazovalo skóre 1 a 13 zvířat vykázalo skóre 2. Všechna zvířata snadno snášela doteky na obličeji (úst a nosu), čili jasnou známku ztráty agresivity (Obr. 21). Klidné ležení na stole bez nutnosti omezení v pohybu je dokumentováno na Obr. 22. Důležité je, že nebyl zjištěn žádný podstatný rozdíl mezi nosním a intramuskulární cestou podání v době do imobilizace a době do ztráty úchopového reflexu.
Tepová frekvence
Dvoucestná ANOVA s následným Tukeyho t-test ukázaly významné účinky oxytocinu (F1,94=14,575, p=0,001) a času po podání (F7,94=12,272, p<0,001) na TF. Intranazální podání oxytocinu vedlo k významnému poklesu TF ve srovnání s intramuskulárním podáním (p=0,002) se statisticky významným rozdílem mezi těmito dvěma způsoby podání ve všech měřených intervalech (Graf. 6B).
Arteriální saturace hemoglobinu kyslíkem
Dvoucestná ANOVA opakovaných měření neprokázala žádné významné rozdíly v SpO2 mezi oběma typy podání (F1,94=1,386, p=0,255, Graf 7B).
55 Střední arteriální krevní tlak
Dvoucestná ANOVA s následným Tukeyho t-testem, prokázala signifikantní vliv oxytocinu (F1,94=7,399, p=0,015) a interakci mezi faktory léčba × čas (F4,94=4,312, p=0,004) na střední arteriální krevní tlak. Intramuskulární podání oxytocinu ve srovnání s intranazálním podáním významně snížilo jeho hodnoty (p=0,015) se statisticky významným rozdílem mezi těmi oběma typy podání po 3 a 5 min od aplikace (Graf. 8B).
Graf 6. Tepová frekvence u králíků (A) a makaků (B) (ANOVA, Tukeyho t-test). * p<0.037;
** p<0.01; *** p<0.001); SD – směrodatná odchylka
56
Graf 7. Saturace hemoglobinu kyslíkem u králíků (A) a makaků (B) (ANOVA, Tukeyho t-test).
SD – směrodatná odchylka
57
Graf 8. Střední arteriální tlak u králíků (A) a makaků (B) (ANOVA, Tukeyho t-test).
***p<0.015, SD – směrodatná odchylka
58
Diskuze
Naše práce je unikátní z několika důvodů. V dostupné literatuře jsme nenašli žádné studie týkající se podání oxytocinu králíkům a studie hodnotící účinek nazálního oxytocinu u opic jsou vzácné a jejich výsledky jsou rozporuplné. Navíc nejsou k dispozici žádná data o použití oxytocinu k sedaci a/nebo ke ztrátě agresivity. Potvrdili jsme naši hypotézu, že oxytocin vyvolává mírnou sedaci. Ačkoli oxytocin není typickým sedativem, naše výsledky jasně prokázaly sedativní účinky oxytocinu podávaného buď intranazálně, nebo intramuskulárně u dvou vývojově odlišných zvířat: králíků a makaků. Knobloch et al. (2012) relativně nedávno popsali axonální projekci hypotalamických neuronů obsahujících oxytocin do velké části oblastí předního mozku, vč. amygdaly; struktury, která hraje důležitou roli při oxytocinem zprostředkovaného potlačení strachu. Ve své práci rovněž uvádí, že uvolňování oxytocinu těmito neuronálními zakončeními může specificky řídit chování související s danou oblastí.
Jako příklad lze uvést pozorování, že oxytocin zprostředkovává anxiolýzu během páření u potkaních samců, čímž podstatně zvyšuje rizikové chování (Waldherr a Neumann, 2007). Navíc již dříve bylo zjištěno, že podávání oxytocinu významně snižuje úzkost u myší měřenou pomocí klasických laboratorních testů (four-plate test, elevated zero-maze test a stresem indukovaná hypertermie). Proto je diskutována jeho možné využití jako anxiolytika u lidí (Ring et al., 2006).
Na druhou stranu existuje ještě mnoho nezodpovězených otázek.
Druhým významným výsledkem naší studie, kromě potvrzení naší hypotézy, jsou rozdílné účinky oxytocinu mezi dvěma různými zvířecími řády - králíky a primáty. U králíků se vyvinula ztrátu polohového reflexu během několika minut u pouze u omezeného počtu jedinců. Ve srovnání s tím byly všechny opice navzdory mírně nižší dávce v přepočtu na tělesnou hmotnost významně sedovány, což se projevilo ztrátou agresivity (klidně ležely na stole a dovolily doteky na obličeji v blízkosti úst a nosu). Vysvětlení není snadné. Můžeme spekulovat, že buď jsou primáti citlivější na účinek oxytocinu, nebo nástroje, které jsme použili pro měření účinku oxytocinu, byly u primátů citlivější než u králíků. První možnost lze podpořit několika studiemi u lidí, kde nízká dávka nazálního oxytocinu (12-24 IU, tj. 0,2-0,4 IU/kg) může vyvolat jemné změny v chování. (MacDonald et al., 2011; MacDonald a Feifel, 2014). Parr et al. (2013) použili 48 IU oxytocinu podaného v nebulizaci a zjistili, že makakové měli selektivně sníženou reakci na negativní projekce obličeje, ale nikoliv na neutrální sociální nebo ne-sociální obrazy, a přitom neměli žádné známky sedace. Druhé vysvětlení může spočívat v tom, že ztráta polohového reflexu u králíků nemusí být dostatečně citlivá na diskrétní změny chování, jako je ztráta reflexu agresivity u primátů. K vyřešení těchto otázek je třeba další výzkum, především
59
proto, že většina pokusů týkající se uvedené problematiky byla provedena na potkanech a myších (MacDonald a Feifel, 2014). Pokud mezidruhové rozdíly opravdu existují, je třeba je vzít v úvahu při dalším výzkumu a při plánování experimentů.
Další rozdíl ve srovnání s většinou prací se týká nástupu účinku, který byl v naší studii poměrně krátký v porovnání s jinými studiemi. Většina z nich se soustředila na měření hladin oxytocinu v různých tělesných kompartmentech a nikoliv na jeho zjevné projevy v chování. Neumann et al. (2013) měřili koncentraci oxytocinu pomocí mikrodialýzy v amygdale a hippokampu u potkanů a myší a prokázali, že po nazálním podání oxytocinu byla maximální hladina dosažena za 30-60 min od podání. Modi et al. (2014) použili mnohem vyšší dávku, než byla v našem experimentu, a měřili koncentraci oxytocinu v mozkomíšním moku u makaků po různých způsobech podání (intravenózním, intranazálním sprejem a aerosolovém intranazálním podání maskou). Všechny tři způsoby podání zvýšily plazmatické koncentrace, ale pouze aerosolové podání významně zvýšilo koncentraci v mozkomíšním moku, což by mohlo být důležitým faktorem pro výsledný efekt. V naší studii se nám podařilo vyvolat sedaci a ztrátu agresivity použitím pouhých 5 IU. Důvodem může být to, že koncentrace mozkomíšního moku neodráží změny chování, které nebyly v Modiho studii měřeny. Gossen at al. (2012) měřil plazmatické hladiny po nazálním podání oxytocinu u lidí a prokázali, že maximální hladiny byly dosaženy 30 min od podání s návratem k výchozí hodnotě po 90-150 min. I v tomto případě může platit, že plazmatická hladiny nemusí nutně odrážet účinky na centrální nervový systém (Gossen et al., 2012).
Zvláště důležité je to, že podávání oxytocinu nemělo žádný vliv ani na střední arteriální tlak ani na saturaci hemoglobinu kyslíkem. Iniciální změny v arteriálním tlaku u makaků na začátku pokusu lze snadno vysvětlit tím, že manipulace se zvířaty na začátku pokusu (při nazálním podávání oxytocinu opicím musela být zvířata mechanicky imobilizována posuvnou stěnou v kleci) měla za následek zvýšený stres zvířat, který zvýšil krevnímu tlak. Pro intramuskulární podání nebyla tak významná imobilizace nutná, navíc zvířata jsou na injekce částečně zvyklá.