V rámci této práce byla testována chelatační schopnost iontů mědi u čtyř látek obsahujících thiolovou skupinu. Na druhou stranu narušení homeostázy mědi související s její zvýšenou hladinou je pro organismus nebezpečné, a to tvorbou volných radikálů. Vzhledem ke schopnosti thiolové skupiny vázat kovové ionty a tvořit chelát jsou chelatační činidla obsahující thiol slibnými sloučeninami pro snižování hladin mědi.
Within this thesis, four compounds with a thiol group were tested for the ability to chelate copper ions. It is a simple, fast but accurate method to determine the chelation properties in vitro. Using the basic hematoxylin method, all tested substances proved to be able to chelate copper.
According to the more competitive bathocuproine method, however, none of the tested substances was a very strong copper chelator. In conclusion, based on these results, the clinical use of these substances in the chelation of excess copper is unlikely.
Seznam zkratek
Úvod
Teoretická část
Fyziologie mědi
- Význam mědi v lidském organismu
- Příjem a metabolismus mědi
- Homeostáza mědi
Po vstřebání ve střevě se váže na sérový albumin nebo v menší míře na transkuprein a je transportován do jater. Specifické chaperony pro měď zahrnují CCS (chaperon pro superoxiddismutázu), COX17 (chaperon pro cytochrom c oxygenázu) a ATOX1 (chaperon pro aktivní transportéry ATPázy ATP7A a ATP7B, které hrají zásadní roli v kinetických událostech na buněčné úrovni) (Gaetke & Chow, 2003; Gupte & Mumper, 2009; Hordyjewska et al., 2014). Je to homotrimer, který vytváří póry nebo iontový kanál v buněčné membráně, což usnadňuje vstup mědi do buňky.
Měď může pro vstup do buňky využívat i jiné, méně specifické transportéry, které však nejsou schopny plně kompenzovat potenciální ztrátu funkce CTR1. Například bylo zjištěno, že po vstupu do buňky se měď nejprve váže na glutathion a teprve poté je sekvestrována metalothioneinem. Deplece chaperonů ATOX1 a CCS neměla žádný zjevný vliv na vstup mědi do buňky, zatímco deplece glutathionu jej snížila (Maryon et al, 2013).
Jeho vyčerpání by proto mohlo vést k akumulaci mědi v buňce v důsledku selhání exportního mechanismu (Bhattacharjee et al, 2017). Po vstupu do buňky přes CTR1 se měď nejprve váže na glutathion a poté na jednotlivé chaperony COX17, CSS a ATOX1, které ji transportují do mitochondrií a TGN.
Patofyziologie mědi
- Toxicita mědi
- Wilsonova choroba (WD)
- Menkesova choroba
- Měď a jiná onemocnění
Špatná funkce tohoto enzymu vede k nadměrnému hromadění mědi v játrech a později v dalších orgánech, jako je mozek, ledviny, srdce a oči. Měď se také neváže na ceruloplasmin a ostatní přenašeče nemají dostatečnou kapacitu pro pojmutí veškerého přebytku mědi. Zjišťuje se množství mědi vyloučené močí a také hladina volné, na ceruloplasmin nevázané, mědi v krvi.
Jedná se o asymptomatická ložiska mědi v membráně rohovky Deskamet, projevující se tvorbou zlatohnědého prstence kolem limbu. Druhým a zásadním rozdílem je, že zatímco u WD je měď hojná, u Menkesovy choroby je tkáňově deficitní. Mutace genu ATP7A Porucha ATP7A vede k hromadění mědi v různých orgánech, ale v játrech a mozku je jí nedostatek.
Abnormální distribuce mědi v jednotlivých tkáních a navíc zvýšený poměr volné mědi k mědi vázané na ceruloplasmin zjevně souvisí s AD. Po úspěšném odstranění nádoru se hladiny mědi vrátí k normálu, což naznačuje, že narušení homeostázy mědi přispívá k rozvoji a růstu nádoru.
Chelatace
- Princip chelatace
- Klinicky používané chelátory mědi
- Chelátory s thiolovými skupinami
Tato skutečnost souvisí s paradoxním neurologickým zhoršením na začátku léčby, které je o něco častější u léčby D-penicilaminem. Problém zhoršení neurologických symptomů se obvykle vysvětluje nadměrnou mobilizací mědi z tkání do krve, kdy část volných iontů mědi může být transportována do mozku, kde je přístup k těmto hydrofilním chelátorům značně omezen (Li et al. 2016; Poujois a Woimant, 2018). Ve své struktuře obsahuje čtyři atomy síry, díky kterým tvoří stabilní komplexy s mědí a proteiny (obr. 6).
Při podávání mezi jídly se vytváří komplex s mědí a albuminem, který je metabolizován v játrech a následně vylučován žlučí. Díky svým silným chelatačním schopnostem má TTM také potenciál stát se důležitým protinádorovým lékem, protože jak již bylo zmíněno výše, zvýšená hladina mědi podporuje angiogenezi a tím i růst nádoru. Nejpoužívanější chelátor mědi D-penicilamin jej ve své struktuře obsahuje, lze tedy tuto schopnost předpokládat i u dalších sloučenin obsahujících thiolové skupiny.
V tomto článku byla testována schopnost kyseliny dimerkaptojantarové (DMSA, kyselina dimerkaptojantarová, také známá jako succimer), kyseliny dimerkaptopropanové (DMPS), N-acetylcysteinu (NAC) a dithiothreitolu (DTT) chelatovat měď. Výjimkou je intoxikace anorganickou rtutí, kde je lékem volby DMPS (Bjørklund et al, 2017; Bjørklund et al, 2019).
Praktická část
Cíl práce
Použitý materiál a pomůcky
- Chemikálie
- Přístroje
Příprava základních a pracovních roztoků
- Příprava základních a pracovních roztoků pro HEM metodu
- Příprava základních a pracovních roztoků pro BCS metodu
Metodický postup
- Stanovení chelatace měďnatých iontů metodou HEM
- Stanovení chelatace měďnatých a měďných iontů metodou BCS
- Stanovení redukce měďnatých iontů
V případě stanovení chelatace iontů mědi 100 µl vhodného pufru (pH a 7,5), 50 µl 250 µM roztoku měďnatých iontů v DMSO a 50 µl roztoku testované látky odpovídající klesající koncentraci. . (c1 – cx) nebo rozpouštědlo (obr. 11). Byl dávkován v objemu 50 ul po další minutě míchání v prvních dvou řadách, stejný objem destilované vody byl pipetován do prázdných řad. Při stanovení iontů mědi byl konečný obsah jamek stejný, jen pracovní postup se mírně lišil.
HA byla pipetována bezprostředně do pufru před přidáním iontů mědi, aby se tyto ionty udržely v redukovaném stavu. Ionty mědi se rychle oxidují na měď ve vodném roztoku bez přítomného redukčního činidla, proto byly míchány po dobu 1 minuty, aby se zajistila jejich redukovaná forma. Poté byla přidána testovaná látka a směs byla znovu míchána po dobu 2 minut, aby se před přidáním indikátoru BCS vytvořil jakýkoli komplex.
Rozdíl byl v tom, že roztok HA byl pouze pipetován do kontrolních jamek a sloužil jako pozitivní kontrola, tzn.
Statistická analýza
Výsledky
24 a 25 je vidět, že NAC, který byl nejslabším chelátorem v metodě HEM (obr. 21-23), vůbec nechelatoval měď nebo ionty mědi metodou BCS. Rychlost chelace se po 5 min snižuje, takže BCS má pravděpodobně schopnost odstraňovat ionty z komplexů testovaných látek a sám je chelatovat. 26 a 27 lze pozorovat pokles chelace v průběhu času a na druhé straně rozdíly mezi jednotlivými pH při chelaci mědi a DMPS iontů mědi.
Oba obrázky ukazují, že chelace se mírně zvyšuje se zvyšujícím se pH a že pouze při pH 7,5 překračuje procento chelátovaných iontů Cu2+/Cu+ 25 % při koncentraci 1:1 a měřeno po 5 minutách. Na rozdíl od DMPS, kde procento chelace při vyšších pH rostlo se zvyšující se koncentrací až na cca 75. Při okamžitém měření se chelatační křivka DMSA nezvýšila ani při vysokých koncentračních poměrech, ale po 5 minutách i při vyšších poměrech. ve srovnání s nižšími poměry dokonce klesla.
Rychlost chelace iontů mědi při koncentraci 1:1 po 5 minutách byla asi 75 % a mírně vyšší chelace byla při vyšším pH. Tam nárůst chelace se zvyšující se koncentrací nebyl tak prudký, ale i s rostoucí koncentrací se rychlost chelace postupně snižovala téměř k nule. Rychlost ionizace mědi byla nižší než u mědi, ale stále alespoň dvakrát vyšší než u ostatních testovaných látek.
Pro lepší ilustraci jsou přiloženy i grafy znázorňující pokles chelace po 5 minutách u metody BCS (obr. 32-34). Pro DMSA mají křivky stejný klesající trend, ale větší pokles je vidět při vyšším pH. Obecně lze ale říci, že pokles chelatace je nějakým způsobem charakteristický pro každou látku.
V grafech znázorňujících redukci měďnatých iontů je také statisticky významný rozdíl v redukční schopnosti testované látky rozpouštědlem při každém pH, tzn. snížení způsobené testovanými látkami však většinou nebylo významně ovlivněno. pH, jak je patrné z připojených tvarů křivek. Na všech grafech je vidět, že testované látky redukují ionty mědi více než rozpouštědlo, a to již od velmi nízkých koncentrací.
Jedinou výjimkou byl succimer při pH 6,8, kde byl statisticky významný rozdíl pouze v určitých bodech, jinak byla redukce srovnatelná s rozpouštědlem. Mezi testovanými látkami má nejvyšší redukční potenciál N-acetylcystein, při koncentraci 1:1 a výše již nebyl rozdíl v čase patrný, protože redukce dosáhla 100 % při vyšších koncentracích ihned po měření.
Diskuze
Z tohoto důvodu nevytváří konkurenční prostředí pro testované látky jako BCS, což je také pravděpodobně důvod, proč grafy neukázaly pokles chelace v průběhu času. Pro pH 4,5 se vůbec nepoužívá, při pH 5,5 se již použít dá, ale vzhledem k velmi nízké absorpci komplexu hematoxylin-Cu2+ při tomto pH nelze touto metodikou dosáhnout velmi přesných výsledků, i když v tomto Případě lze odečíst možnou stechiometrii výsledného komplexu (Říha et al, 2013). Kromě měření stupně chelace jsme také zjišťovali, zda testované látky mají schopnost redukovat ionty mědi na ionty mědi.
Je možné, že použití slabých chelátorů, které jsou zároveň redukčními činidly, může potenciálně zvýšit produkci volných radikálů, zatímco použití silného chelátoru může naopak blokovat redoxní cyklus mědi (Říha et al, 2013). . . V případě našich látek se však jedná o první případ, kdy chelace v konkurenčním prostředí nebyla příliš vysoká, ale redukce byla ve všech případech vyšší než u použitého rozpouštědla. U DMSA to byl podobný případ jako u DMPS, redukce opět zvítězila nad chelací (obr. 28 a obr. 37) o cca. čtyřikrát.
V tomto případě by pravděpodobně záleželo na tom, zda by použitá koncentrace DMPS nebyla pro organismus příliš toxická. To není případ dithithreitolu, kde rychlost chelace měla vrchol při koncentraci 1:1 a snížení naopak, i když s mírným poklesem v průběhu křivky, stále roste se zvyšující se koncentrací DTT. Přestože tedy tato látka chelatovala nejvíce ze všech testovaných látek v metodice BSC, její silný redukční potenciál brání jejímu použití v chelatační terapii.
Tedy alespoň při vyšším pH 6,8 a 7,5 buď nebyl statisticky silnějším reduktorem než rozpouštědla, nebo byl, ale jeho účinnost byla relativně malá (obr. 37CD). Pokud jde o rychlost chelace, mírně se zvyšovala se zvyšující se koncentrací succimeru při pH 6,8 a 7,5. Pro své výhody se DMSA může stát perorálním lékem volby v dlouhodobé terapii Wilsonovy choroby, ale možná v kombinaci s alfa tokoferolem jako lapačem volných radikálů na začátku terapie (Cao et al, 2014).
Pokud je však podáván co nejdříve a opakovaně ve vysokých koncentracích, současně s perorálním D-penicilaminem, může odstranit závažné příznaky akutní fáze onemocnění. Zde je možné, že i přes relativně slabou chelataci mědi v testech lze tuto látku, zejména DMPS a DMSA, použít v terapii Wilsonovy choroby. Paradoxně to souvisí jak s efektem – uvolňováním mědi z tkání a jejím následným vylučováním z těla, tak s některými vedlejšími účinky, jako je možné neurologické zhoršení na začátku terapie (Litwin et al, 2015) .
Závěr
Seznam použité literatury
Chelation of copper by D-penicillamine generates reactive oxygen species that are cytotoxic to human leukemia and breast cancer cells. Altered serum copper homeostasis suggests higher oxidative stress and lower antioxidant capacity in patients with chronic hepatitis B. Therapeutic potential of N-acetyl cysteine with antioxidant (Zn and Se) supplementation against dimethylmercury toxicity in male albino rats .
New rapid copper chelation assay method confirmed low affinity of D-penicillamine for copper compared to trientine and 8-hydroxyquinolines. Redox- and non-redox-metal-induced formation of free radicals and their role in human diseases.
